何克喆，皮 妍，郭 蘇

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200438; 2.加州大學(xué)舊金山分校 生物工程與治療科學(xué)系 加利福尼亞, 美國 94143-2811)

人類dia1r(delete-in-autism 1 related gene)基因，又名dipk2b(divergent protein kinase domain 2B)，位于人類基因組的X染色體上[1]，是孤獨癥譜系障礙相關(guān)基因.dia1r是DIA1家族同源基因[2]，這個家族有3個基因，分別是dia1a，dia1b，dia1r，他們共同包含了FAM69蛋白激酶結(jié)構(gòu)域[3-4].

dia1r基因只存在于脊椎動物中，與脊椎動物的全基因組重復(fù)事件(Genome Wide Repeat events, WGD)和動物進化出高級神經(jīng)系統(tǒng)的時間高度吻合.通過對多種魚類進行基因組測序并對比后發(fā)現(xiàn)，dia1r只存在于群居性魚類的基因組中，而更加獨居性的魚類基因組中則沒有發(fā)現(xiàn)[2].目前，已經(jīng)有兩例脆性X染色體綜合征(Fragile X Syndrome, FXS)患者中發(fā)現(xiàn)了dia1r的非同義突變[5-6].還有一些文獻報導(dǎo)了包含dia1r基因在內(nèi)的Xp11.3染色體區(qū)域與神經(jīng)系統(tǒng)的疾病相關(guān)[7]，此區(qū)域的缺失導(dǎo)致了一例男性孤獨癥高易感性[8]和一例先天性Kaburi綜合征[9].另一項臨床病例發(fā)現(xiàn)，缺失dia1r可能會導(dǎo)致患者出現(xiàn)面部畸形、智力障礙和語言發(fā)育遲緩等癥狀[10].對雛雞發(fā)育過程中cdia1r表達的分析表明，該基因在卵黃囊血管母細胞、血島和背主動脈、心內(nèi)膜和頭部血管內(nèi)皮細胞中表達[11]，這些區(qū)域的共同特征是都具有造血能力.進一步的研究發(fā)現(xiàn)，cdia1r在血源性內(nèi)皮細胞中的表達量更高，在腦神經(jīng)上皮中的血管內(nèi)皮和類似小膠質(zhì)細胞的分離細胞中也有表達[11].其他模式生物中的研究也發(fā)現(xiàn)dia1r在造血細胞和神經(jīng)系統(tǒng)中表達，在斑馬魚胚胎的造血祖細胞和內(nèi)皮細胞(cc058基因)[12]、胚胎和成年小鼠大腦的內(nèi)皮細胞和小膠質(zhì)細胞(4930578C19Rik基因)[13]以及人內(nèi)皮細胞中都檢測到了dia1r同源基因的轉(zhuǎn)錄本[14].這些進化及臨床證據(jù)均暗示dia1r與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及孤獨癥譜系障礙的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系.

孤獨癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorders, ASDs)是一種由遺傳因素影響的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床上主要有3個診斷依據(jù): 語言障礙、社交障礙和重復(fù)刻板的行為[15].因此，相比于解剖學(xué)、生理學(xué)等檢測方法，行為檢測方法往往能夠提供與人類ASDs的核心癥狀更相關(guān)的數(shù)據(jù)[16]，而行為學(xué)實驗也成為了在動物模型中鑒定ASDs的重要依據(jù).近年來，越來越多的研究人員使用斑馬魚作為ASDs的動物模型.與小鼠不同，斑馬魚在白天活躍，對光暗周期的偏好更類似于人類[17]，再加上體積小、繁殖能力強、胚胎期透明、行為學(xué)表型豐富等優(yōu)點[18-19]，斑馬魚在高通量行為學(xué)實驗中有著巨大的優(yōu)勢，目前已越來越廣泛地用于ASDs的研究之中.

本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建斑馬魚的dia1r基因敲除突變體，成功獲得了穩(wěn)定遺傳的純合突變體.同時本研究也檢測了dia1r敲除突變體的行為學(xué)表型，對純合突變體幼魚進行了自發(fā)運動能力分析、趨觸性分析、光暗交替刺激分析，對純合突變體成魚進行了新缸實驗分析、社交偏好分析.

1 材料和方法

1.1 實驗動物和菌株

野生型斑馬魚(AB品系)由復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室斑馬魚研究中心提供.養(yǎng)殖系統(tǒng)由上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司提供，斑馬魚喂養(yǎng)及產(chǎn)卵方案依據(jù)相關(guān)文獻建立，并按照Kimmel等人描述對胚胎進行發(fā)育階段分期[20].本研究中斑馬魚的相關(guān)實驗全部按照復(fù)旦大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)定進行.載有pT7-gRNA的E.coliDH5α菌株和載有pGH-T7-zCas9的E.coliDH5α菌株均由范德堡大學(xué)分子生理學(xué)與生物物理學(xué)系陳文標教授實驗室提供.

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建斑馬魚CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)

從Ensembl網(wǎng)站(http://asia.ensembl.org/index.html)下載dia1r基因序列(ENSDARG00000061747)，選取其進化最保守的區(qū)域蛋白激酶結(jié)構(gòu)域所對應(yīng)的序列設(shè)計gRNA(guide RNA)，通過CCTop網(wǎng)站(https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)[21]、麻省理工學(xué)院張鋒實驗室網(wǎng)站(https://zlab.bio/guide-design-resources)[22]和CHOPCHOP網(wǎng)站(http://chopchop.cbu.uib.no/)[23]分別設(shè)計評分，根據(jù)三者反饋的列表綜合選取最優(yōu)的gRNA序列，其靶標位點為GAGAGGAAAACAGGGTCCTGAGG(表1，已用下劃線標出)，其中AGG為PAM序列.

表1 實驗所用引物

將pT7-gRNA作為模板，以gRNA引物和載體通用引物分別作為正反向引物，擴增gRNA體外轉(zhuǎn)錄線性化模板.回收純化后再使用MEGAscriptTMT7 Transcription Kit(Invitrogen,AM1333)體外轉(zhuǎn)錄gRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用Spin Sequencing Reaction Clean-Up試劑盒回收純化，經(jīng)Nanodrop測定濃度后，置于-80℃保存.

pGH-T7-zCas9載體[24]上的Cas9序列針對斑馬魚進行過密碼子優(yōu)化，因此更適用于本實驗.擴增培養(yǎng)載有pGH-T7-zCas9的E.coliDH5α菌株并獲得質(zhì)粒pGH-T7-zCas9，使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ對載體進行酶切，將酶切產(chǎn)物進行凝膠電泳分離，使用膠回收試劑盒回收線性化質(zhì)粒片段.將回收的線性化質(zhì)粒片段作為模板，使用T7 mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion, AM1344)體外轉(zhuǎn)錄獲得Cas9 mRNA.使用Poly(A)Tailing Kit(invitrogen, AM1350)為Cas9 mRNA進行3’末端加Poly A尾反應(yīng).所得的反應(yīng)產(chǎn)物使用MEGAclear Transcription Clean-Up Kit(Invitrogen, AM1908)回收.回收產(chǎn)物經(jīng)Nanodrop儀器測定濃度后，保存于-80℃.

1.2.2 構(gòu)建dia1r基因斑馬魚敲除突變體

將Cas9 mRNA和gRNA分別用RNase free water稀釋，并配置顯微注射緩沖液，緩沖液中Cas9 mRNA終濃度為300ng/μL，gRNA終濃度為20ng/μL.在斑馬魚胚胎受精后的單細胞期對細胞進行顯微注射，注射的斑馬魚胚胎數(shù)量應(yīng)不少于100顆，并留下至少30顆同批未注射胚胎作為對照組.

等到胚胎發(fā)育至1dpf(days post fertilization)時，取實驗組斑馬魚胚胎和對照組斑馬魚胚胎分組提取基因組DNA.設(shè)計引物以基因組DNA為模板PCR擴增gRNA靶標位點上下游序列(flanking sequence)，使用PpumⅠ對擴增產(chǎn)物進行酶切，檢測gRNA靶標位點的基因編輯效率.將檢測結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物進行測序確認是否發(fā)生基因編輯.根據(jù)測序結(jié)果，把發(fā)生基因編輯的斑馬魚胚胎培養(yǎng)至成魚，稱為F0代突變體.

1.2.3 篩選獲得穩(wěn)定遺傳的純合敲除突變體

將F0代成魚與野生型成魚外交(out cross)，取10顆所得胚胎于1dpf時期抽提基因組，PCR擴增靶標位點上下游序列后，測序確認是否產(chǎn)生堿基移碼突變.但由于此時無法單胚胎檢測基因組，所以要將F0代成魚與野生型成魚外交獲得的F1代胚胎培養(yǎng)至成魚，通過剪尾測序的方法檢測F1代成魚基因型.F1代成魚為雜合敲除突變體，為防止gRNA探針脫靶對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，將F1代雜合敲除突變體與野生型外交，獲得的胚胎養(yǎng)大至成魚后剪尾檢測基因型，篩選獲得F2代雜合敲除突變體.

將獲得的F2代雜合敲除突變體養(yǎng)至成魚，自交后獲得F3代胚胎，將胚胎培養(yǎng)至成魚，剪尾檢測基因型，檢測完成后分缸培養(yǎng).將F3代純合突變體自交，收集F4代胚胎并養(yǎng)至成魚.F4代斑馬魚均為無母源表達的純合突變體，即穩(wěn)定遺傳的dia1r純合突變體.

1.2.4 行為學(xué)實驗

將獲得的斑馬魚dia1r-/-突變體自交，所繁殖的同一批胚胎放入培養(yǎng)箱中養(yǎng)至7d.以同批次野生型幼魚作為對照組，在24孔板中每孔加入1mL藍水，放入一條7dpf幼魚.做好標記后將24孔板放入Noduls行為學(xué)分析儀箱體內(nèi)，視頻記錄實驗數(shù)據(jù)，使用graphpad軟件進行實驗數(shù)據(jù)的分析與作圖.實驗過程中，溫度保持在28.5℃左右.記錄斑馬魚行為時，周圍保持安靜，以排除噪音對實驗的干擾.

1.2.4.1 曠場實驗

斑馬魚在24孔板中自由游動(圖1(a))，箱體內(nèi)的攝像機可以記錄其運動軌跡，根據(jù)運動軌跡統(tǒng)計運動距離、平均速度、活躍程度、角速度等參數(shù)[25-26].

圖1 行為學(xué)實驗?zāi)Ｊ綀D

趨觸性是指在一個新奇的環(huán)境中，斑馬魚是否會自發(fā)的接近容器的邊緣地帶的特性.趨觸性可以衡量斑馬魚對一個陌生環(huán)境的焦慮程度[27].將24孔板中的每個孔劃分為中心區(qū)和外周區(qū)這兩個面積相同的觀察區(qū)(圖1(a))，通過計算斑馬魚幼魚在兩個觀察區(qū)內(nèi)游動的距離比值來考查趨觸性.計算公式為: 趨觸值=(外周區(qū)游動距離-中心區(qū)游動距離)/(外周區(qū)游動距離+中心區(qū)游動距離).

1.2.4.2 光暗交替實驗

為了檢測突變體斑馬魚在不同光照條件下自發(fā)運動能力、趨觸性等特征，通過控制行為學(xué)實驗儀器的光照強度，可以考察dia1r-/-幼魚對光暗交替刺激的反應(yīng).首先將斑馬魚幼魚放入明場環(huán)境下適應(yīng)30min，再以5min的頻率進行光暗交替刺激.以10s為單位統(tǒng)計幼魚在細分時間內(nèi)的平均運動速度和趨觸值，觀察斑馬魚突變體與野生型的區(qū)別.

1.2.4.3 新缸實驗

使用新缸實驗分析斑馬魚成魚的焦慮程度.將斑馬魚成魚放置在一個長30cm、寬為10cm、高為15cm的透明魚缸中觀察10min.透明魚缸從上到下等分為3個區(qū)域，分別為頂部區(qū)(upper zone)，中間區(qū)(middle zone)和底部區(qū)(bottom zone)，使用攝像機記錄斑馬魚成魚在這3個區(qū)域所持續(xù)的時間(圖1(b)).實驗結(jié)束后，將使用的斑馬魚放回到斑馬魚系統(tǒng)中.

1.2.4.4 成魚社交偏好實驗

將斑馬魚放入成魚社交偏好實驗裝置(圖1(c))中.在缸的一側(cè)放入5～6條斑馬魚，另一側(cè)則不放任何物體，通過斑馬魚在社交區(qū)(conspecific arm)與空箱區(qū)(empty arm)的游動時間比值來計算斑馬魚社交偏好值[28].計算公式為: 社交偏好值=(社交區(qū)游動時間-空箱區(qū)游動時間)/(社交區(qū)游動時間+空箱區(qū)游動時間)×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點基因編輯效率

將合成的gRNA和Cas9 mRNA混勻后，顯微注射進單細胞期胚胎中，以5顆為一組，選取3組注射后24h的斑馬魚胚胎擴增其上下游序列(引物見表1)，檢測基因編輯效率.研究發(fā)現(xiàn)所選取的3組胚胎均被限制性內(nèi)切酶PpumⅠ切割，但都沒有切割完全(圖2)，說明注射組斑馬魚的確發(fā)生了基因編輯.考慮到PpumⅠ酶切效率低，無法準確反映基因編輯效率，同時也使用TA克隆對突變效率進行了檢測，結(jié)果表明: 3組中突變效率分別為6/8,7/8,6/8，平均效率為79%，其中包括4種缺失突變，-1bp占比50%，-2bp占比4%，-13bp占比15%，-15bp占比10%，均為有義突變.

圖2 檢測gRNA效率

2.2 鑒定穩(wěn)定遺傳的dia1r基因敲除突變體斑馬魚

F0代成魚與野生型魚進行1∶1交配，收集獲得的F1代胚胎養(yǎng)至性成熟，剪尾鑒定其基因型.F1代中共檢測了32條成魚，其中有12條出現(xiàn)雙峰，說明這12條F1代成魚為雜合突變體，突變效率為37.5%.使用TA克隆檢測雜合突變體的突變類型，其中5條雌魚和3條雄魚出現(xiàn)單拷貝1bp缺失，1條雄魚和1條雌魚出現(xiàn)單拷貝13bp缺失，2條雄魚出現(xiàn)單拷貝15bp缺失，具體缺失堿基位置見圖3(a)(第40頁).所獲得的F1代雜合突變體分別為dia1rΔ1/wt(單拷貝缺失1bp)，dia1rΔ13/wt(單拷貝缺失13bp)，dia1rΔ15/wt(單拷貝缺失15bp).其中dia1rΔ15/wt會導(dǎo)致DIA1R蛋白缺失5個氨基酸，并不發(fā)生移碼突變，而dia1rΔ1/wt和dia1rΔ13/wt則為同一個閱讀框，會發(fā)生同樣的無義突變導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，dia1rΔ13/wt會比dia1rΔ1/wt多缺失4個氨基酸(圖3(b)，第40頁).3個突變體都破壞了DIA1R蛋白的功能結(jié)構(gòu)域FAM69蛋白激酶結(jié)構(gòu)域.

將F1代成魚中dia1rΔ1/wt與野生型斑馬魚雜交，所產(chǎn)的F2代胚胎培養(yǎng)至成魚后剪尾鑒定基因型，共鑒定30條F2代成魚，其中雜合突變體13條，5條雌魚8條雄魚，野生型17條.將F2代雜合突變體雌雄魚自交，獲得F3代胚胎，長至性成熟后鑒定其基因型，共鑒定34條，其中純合突變體8條，雜合突變體19條，野生型7條(圖3(c)，第40頁).為了去除母源攜帶的dia1rmRNA的影響，將F3代純合突變體自交，收集F4代胚胎并養(yǎng)至成魚.F4代斑馬魚均為無母源表達的純合突變體，即穩(wěn)定遺傳的dia1r-/-純合突變體.

圖3 F1雜合突變體及F3代成魚基因型的鑒定

2.3 持續(xù)光照條件下dia1r-/-幼魚自發(fā)運動能力降低

獲得dia1r-/-純合突變體后，我們觀察其對斑馬魚的死亡率、發(fā)育、形態(tài)、致畸率等基本表型有無影響，發(fā)現(xiàn)其與野生型對照組無差異(數(shù)據(jù)未顯示).為了進一步觀察dia1r突變對斑馬魚的影響，我們進行了行為學(xué)分析.以野生型幼魚為對照組，分析dia1r-/-幼魚的自發(fā)運動能力.結(jié)果表明，相對于野生型幼魚，dia1r-/-幼魚自發(fā)運動速度顯著降低(圖4(a，c)).將斑馬魚運動速度超過0.4cm/s時定義為狂躁狀態(tài)[25]，dia1r-/-幼魚在10min內(nèi)出現(xiàn)狂躁狀態(tài)的次數(shù)較野生型幼魚顯著下降(圖4(b)).這兩個指標都說明dia1r-/-幼魚自發(fā)運動能力較野生型有所降低.

圖4 持續(xù)光照條件下dia1r-/-幼魚自發(fā)運動降低

2.4 持續(xù)光照條件下dia1r-/-幼魚趨觸性減弱

趨觸性能夠反映斑馬魚在陌生環(huán)境中的焦慮程度，趨觸性強的幼魚在24孔板中會緊貼孔壁游動(如圖5(a)，左側(cè)趨觸性強于右側(cè))[25].在對dia1r-/-幼魚的進行趨觸性分析時發(fā)現(xiàn)，相較于野生型斑馬魚，dia1r-/-幼魚在外周區(qū)和中心區(qū)的游動速度有顯著差異，在外周區(qū)的游動速度更快(圖5(b)).而且，對比野生型幼魚分別在外周區(qū)及中心區(qū)的持續(xù)時間，可以發(fā)現(xiàn)dia1r-/-幼魚在兩個區(qū)域所持續(xù)的時間差值相對于野生型幼魚更小(圖5(d)).通過上文中公式計算趨觸值，可以看到dia1r-/-幼魚相比于野生型幼魚趨觸性顯著減弱了(圖5(c))，說明dia1r-/-幼魚較野生型幼魚有更低的焦慮水平.

圖5 持續(xù)光照條件下dia1r-/-幼魚趨觸性降低

2.5 光暗交替條件下dia1r-/-幼魚對光照變化比野生型更加敏感

有文獻報導(dǎo)表明在黑暗條件下，斑馬魚幼魚更傾向表現(xiàn)出焦慮行為[29-30]，在不同的光照條件下斑馬魚的行為差異成為檢測神經(jīng)系統(tǒng)疾病的依據(jù)[31].圖6(a)中可以看出，在光暗交替過程中，黑暗條件下dia1r-/-幼魚與對照組幼魚的游動速度沒有明顯的差異，而當轉(zhuǎn)換為光照條件時，則dia1r-/-幼魚的游動速度低于對照組幼魚.

圖6 光暗交替條件下dia1r-/-幼魚與wt幼魚的行為差異

圖6(b)中統(tǒng)計了D1、L1、D2、L2 4個時期幼魚的運動速度，在L1、L2兩個時期dia1r-/-幼魚與野生型幼魚具有顯著性差異.同時在光暗交替的瞬間，dia1r-/-幼魚表現(xiàn)出更加突出的自發(fā)運動(圖6(a)中箭頭處)，說明其對光暗交替表現(xiàn)出更大的驚嚇反應(yīng).對dia1r-/-幼魚在外周區(qū)累計持續(xù)的時間進行統(tǒng)計，也發(fā)現(xiàn)在光暗交替的瞬間，突變體斑馬魚會更多的脫離外周，向中心區(qū)移動(圖6(c)中箭頭處)，這兩者都說明了dia1r-/-幼魚對光暗交替刺激更加敏感.

2.6 dia1r-/-成魚比野生型成魚表現(xiàn)出更低的焦慮水平

dia1r-/-斑馬魚在成年后仍可以存活和繁殖.我們使用新缸實驗檢測dia1r-/-成魚的焦慮程度.當斑馬魚成魚被突然置于陌生的環(huán)境中時，通常會選擇趨向于在底部活動，并減少探索行為以保證安全[32].隨著斑馬魚逐漸適應(yīng)新的環(huán)境，其探索行為通常會增加，在魚缸頂部的活動時間也會增加[33].我們使用具有頂部區(qū)、中間區(qū)和底部區(qū)的三室透明水箱進行試驗(圖7(a))，我們發(fā)現(xiàn)dia1r-/-成魚在頂部區(qū)、中間區(qū)的時間顯著多于野生型成魚，而在底部區(qū)的時間顯著低于野生型成魚(圖7(c)).并且，dia1r-/-成魚和野生型成魚的運動速度沒有顯著差異(圖7(b))，說明該表型并非由運動缺陷引起.這些數(shù)據(jù)表明，dia1r-/-成魚比野生型成魚的焦慮水平要低.

圖7 dia1r-/-和野生成魚新缸實驗結(jié)果

2.7 雄性dia1r-/-成魚比野生型成魚表現(xiàn)出更弱的社交偏好

待dia1r-/-斑馬魚長至成魚后，檢測其自發(fā)運動能力和社交偏好.使用6月齡dia1r-/-雌魚10條，dia1r-/-雄魚10條，野生型雌魚10條，野生型雄魚10條，逐一放入裝置中檢測，社交偏好強的斑馬魚更喜歡在conspecific arm區(qū)域游動(例如圖8(a)，右缸較左缸魚具有更強的社交偏好).分別對比雌性和雄性斑馬魚后發(fā)現(xiàn)，dia1r-/-成魚的自發(fā)運動速度與對照組之間的差異并不具有顯著性(圖8(b)).通過上文中公式計算社交偏好值，研究表明，雌性dia1r-/-成魚較對照組的社交偏好沒有顯著差異，而雄性dia1r-/-成魚相比于對照組表現(xiàn)出更弱的社交偏好(圖8(c)).

圖8 dia1r-/-和野生成魚社交偏好實驗結(jié)果

3 討 論

CRISPR/Cas9是一種目前使用廣泛的基因組靶向編輯技術(shù)，現(xiàn)在已有實驗室成功通過添加不同的gRNA以實現(xiàn)在多個基因位點同時引入突變[34]，為高通量基因編輯提供一種技術(shù)途徑.但與此同時，CRISPR系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)(off-target)也不可忽視，脫靶效應(yīng)可能會在非特異靶向位點造成基因編輯，破壞未知基因的功能，從而對基因突變表型鑒定帶來諸多不利影響[35]，是CRISPR系統(tǒng)用于高通量基因編輯技術(shù)必須要克服的一個阻礙.目前已有多種方法減少CRISPR系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)的影響[36]，本研究為了避免脫靶效應(yīng)導(dǎo)致的非特異性基因編輯，從兩個方面進行了改進: 首先，使用多個gRNA設(shè)計平臺分別對不同gRNA候選靶位點的脫靶效應(yīng)和序列特征打分，選取綜合評分最好的gRNA；第二，將雜合突變體與野生型斑馬魚交配繁殖，從而盡可能地篩選清除掉與實驗位點不連鎖遺傳的脫靶位點上的基因突變.

近年來，斑馬魚已經(jīng)成為ASDs研究領(lǐng)域十分重要的動物模型[37].許多行為測試已經(jīng)在斑馬魚模型中被開發(fā)出來，包括對社會互動、求新、求愛、抑制回避、恐懼和焦慮反應(yīng)、重復(fù)/刻板行為、癲癇和攻擊的評估等[38-40].一些斑馬魚ASDs基因缺陷模型也表現(xiàn)出行為學(xué)的異常，例如2016年Hoffman等敲除ASDs相關(guān)基因cntnap2后發(fā)現(xiàn)突變體斑馬魚表現(xiàn)出夜間亢奮行為[41].而syngap1和shank3a雙基因敲除表現(xiàn)出運動能力下降、無效逃逸行為和類癲癇樣行為[42].shank3b基因的敲除導(dǎo)致斑馬魚的運動能力和社會交往能力下降[25].dyrk1a基因敲除的斑馬魚表現(xiàn)出社交障礙[43].本文對所構(gòu)建的dia1r純合突變體進行的行為學(xué)分析表明，相較于野生型對照組，純合突變體幼魚在持續(xù)光照條件下自發(fā)運動能力減弱，趨觸性減弱，而在光暗交替情況下，純合突變體幼魚表現(xiàn)出對光照刺激更強的敏感性.這些結(jié)果與ASDs相關(guān)基因shank3b[25]、dyrk1a[43]等基因的行為學(xué)表型類似，但尚不確定這些表型是否是ASDs相關(guān)基因在斑馬魚中的普遍表型.另外，我們也觀察到雄性純合突變體成魚比野生型成魚表現(xiàn)出更弱的社交偏好，而在雌性成魚中則沒有顯著性的差異.這種因為性別差異而導(dǎo)致表型不同的現(xiàn)象在ASDs相關(guān)基因的研究中普遍存在，在人類ASDs患者[44-46]和小鼠[47-48]中都有發(fā)現(xiàn)，但其中具體的機制還不是很明確.

在本研究中，我們成功獲得穩(wěn)定遺傳的dia1r基因敲除純合突變體，并通過行為檢測發(fā)現(xiàn)純合突變體幼魚自發(fā)運動能力減弱，趨觸性減弱，而且雄性純合突變體成魚表現(xiàn)出更弱的社交偏好.這些結(jié)果與其他ASDs相關(guān)基因的行為學(xué)表型類似，給了我們一些對dia1r基因功能的猜測，為更進一步的機制研究奠定了良好的基礎(chǔ).同時，本文所構(gòu)建的dia1r純合突變體也有望成為ASDs疾病模型，為進一步揭示孤獨癥譜系障礙的致病機制及藥物篩選提供工具.