楊志剛，張 龍，陳春宇，成永旭，夏冬梅

(1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；3.福建省水產(chǎn)功能性飼料與養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州 363000)

水通道蛋白是一類跨膜蛋白，允許水和甘油等小的不帶電荷的溶質(zhì)穿過脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜[1-4].迄今為止，已經(jīng)鑒定出13個(gè)哺乳動(dòng)物水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)成員(AQP0～AQP12)，其中AQP0～AQP10功能已得到驗(yàn)證[5-6].AQP家族根據(jù)其滲透性特征可分為3組，即經(jīng)典的水選擇性水通道蛋白(AQP0，AQP1，AQP2，AQP4，AQP5)和甘油轉(zhuǎn)運(yùn)水通道蛋白(AQP3，AQP7，AQP9，AQP10)以及尚未闡明其功能的水通道蛋白(AQP11和AQP12)[3,7-9].目前，對(duì)于水生動(dòng)物水通道蛋白的研究主要集中在魚類中[10-12]，對(duì)甲殼類動(dòng)物的研究較少[4,13-14].

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis,Es)在我國長江中下游的河流和湖泊中廣泛分布，是一種具有養(yǎng)殖前景的經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物.本文成功從中華絨螯蟹鰓組織中克隆獲得了EsAQP1的全長互補(bǔ)DNA(cDNA)，通過熒光定量PCR(qPCR)分析EsAQP1在不同組織中的表達(dá)模式，并分析了其序列特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，通過測(cè)定鹽度脅迫和dsRNA作用下中華絨螯蟹蛋白Na+-K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NKCC)基因和鈉鉀泵(Na+/K+-ATPase)基因的表達(dá)，進(jìn)一步探討了EsAQP1在滲透壓調(diào)節(jié)方面的功能，可為研究甲殼動(dòng)物水通道蛋白與滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制之間的關(guān)系積累基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

從上海海洋大學(xué)崇明基地捕捉實(shí)驗(yàn)用的中華絨螯蟹，體質(zhì)量(6.50±1.21)g，暫養(yǎng)一周，水溫21～25℃.水體pH7.5～8.0，持續(xù)充氧，每天換1/3養(yǎng)殖水，于每天18∶00定時(shí)投喂商品飼料.隨機(jī)挑選健康的中華絨螯蟹分為3組：低鹽度組(12‰)、高鹽度組(24‰)、對(duì)照組(0‰)，每個(gè)組設(shè)6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60只.利用淡水、鹵水配制實(shí)驗(yàn)設(shè)置的鹽度，每天更換一半養(yǎng)殖水量，同時(shí)進(jìn)行鹽度校準(zhǔn).分別于0，3，6，12，24，48，72和96h，每組隨機(jī)選取6只健康個(gè)體，置冰上麻醉采樣，解剖取其鰓和腸組織，用于RNA提取.同樣每組另外取6只健康個(gè)體，冰上麻醉后解剖，分別取其腦、胸神經(jīng)、肝胰腺、肌肉、腸、心臟、腦、血、胃和鰓組織.提取的所有組織均迅速用液氮速凍，并保存在-80℃冰箱，用于熒光定量測(cè)定.

1.2 EsAQP1基因全長cDNA的克隆及鑒定

使用RNAiso(TaKaRa，日本)提取中華絨螯蟹后鰓的總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄獲得其第1鏈cDNA(PrimeScriptTMⅡ試劑盒TaKaRa，日本)，將特異性引物AQP-F1和AQP-R1(表1)分別與通用引物UPM配對(duì)，分別進(jìn)行3’-RACE和5’-RACE擴(kuò)增.實(shí)驗(yàn)所有引物合成及測(cè)序均由生工生物(上海)股份有限公司完成.

1.3 序列分析

利用BLASTn和BLASTx(http：//blast.nlm.nih.gov/Blast.cgi)鑒定相關(guān)生物中的同源序列并驗(yàn)證其相似性.采用ORF Finder程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)預(yù)測(cè)氨基酸序列和EsAQP1核苷酸序列的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF).利用ExPASy軟件來預(yù)測(cè)AQP1蛋白的等電點(diǎn)、分子量和氨基酸功能域.利用DNAMAN和MEGA 5.0軟件，與三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、可口美青蟹(Callinectessapidus)、美洲鱟(Limuluspolyphemus)、溫室擬肥腹蛛(Parasteatodatepidariorum)等物種的序列進(jìn)行多重比較并構(gòu)建進(jìn)化樹.

1.4 AQP1-mRNA組織定量分析

通過qRT-PCR分析AQP1mRNA在不同組織中的表達(dá).以中華絨螯蟹18S-RNA基因作為內(nèi)參基因，使用PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Time)將各組織的總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈.并針對(duì)AQP1和18S-RNA設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)特異性引物(表1).10μL qRT-PCR反應(yīng)包含5μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)，3.6μL ddH2O級(jí)水，1.0μL稀釋的cDNA模板(兩倍稀釋)和0.2μL(10μmol/L)正/反引物.在ABIPRISM?7500儀器(美國Applide Biosystems)中進(jìn)行qRT-PCR，運(yùn)行程序?yàn)?5℃30s，95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析程序?yàn)椋?5℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s.通過2-ΔΔCt法用Excel軟件分析EsAQP1的相對(duì)表達(dá)量.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列

1.5 EsAQP1基因干擾實(shí)驗(yàn)

1.5.1 雙鏈RNA(dsRNA)合成

使用基因特異性引物AQP1-R1，AQP1-F1，AQP1-R2，AQP1-F2，AQP1-R3，AQP1-F3，AQP1-R4和AQP1-F4進(jìn)行dsRNA制備DNA模板5’端(表2).作為對(duì)照，選取模板需帶有綠色熒光蛋白(GFP)載體，引物擴(kuò)增GFP dsRNA需具有T7啟動(dòng)子序列，如表2所示.PCR產(chǎn)物通過TIANprep Mini Plasmid Kit(天根生化科技，中國)純化并用作模板.用T7高效轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen Biotech，中國)合成AQP1(dsRNA 1,2,3,4,5)和GFPdsRNA.合成的dsRNA利用瓊脂糖電泳驗(yàn)證，再利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度.

表2 干擾實(shí)驗(yàn)用引物

1.5.2 基因沉默和熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)用中華絨螯蟹放在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖一周后，取出置于冰上麻醉10min，然后用70%的乙醇浸泡中華絨螯蟹消毒10min，再取其鰓組織，體外培養(yǎng)并用3種不同的方式處理：(1)加入1μL GFP dsRNA；(2)加入1μL AQP1 dsRNA-1；(3)空白對(duì)照組.鰓組織在26℃培養(yǎng)1，2，4和8h后分別提取其總RNA，利用熒光定量檢測(cè)NKCC和Na+/K+-ATP基因的相對(duì)表達(dá)水平.

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析(Analysis of Variance, ANOVA)，并進(jìn)行Duncan’s多重比較分析各組間的差異性，P<0.05為差異顯著水平.

2 結(jié) 果

2.1 EsAQP1 cDNA克隆和序列分析

EsAQP1的cDNA全長為1646bp，開放閱讀框(ORF)為1119bp，編碼373個(gè)氨基酸，基因序列中存在199bp的5’-非翻譯區(qū)(UTR)和325bp的3’-UTR.推導(dǎo)的水通道蛋白的分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)為39.367kDa和5.1.氨基酸組成分析表明，EsAQP1編碼的多肽鏈具有22個(gè)帶正電荷氨基酸殘基(Arg和Lys)，32個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp和Glu)，并且不穩(wěn)定性系數(shù)為29.04.疏水性為0.168，屬于穩(wěn)定蛋白.ExPASy軟件分析顯示，EsAQP1蛋白包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(分別位于21～48、54～76、97～119、139～160、172～193和213～233)和2個(gè)NPA(Asn-Pro-Ala)域和一個(gè)片段MIP家族(HINPAVT)的保守序列(圖1，第96頁).

2.2 同源性和進(jìn)化樹分析

使用DNAMAN軟件對(duì)EsAQP1的氨基酸序列和具有較高同源性的其他物種進(jìn)行多重比對(duì)(圖2，第97頁).中華絨螯蟹與三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)相似性為74.42%，同源性最高，與可口美青蟹(Callinectessapidus)、美洲鱟(Limuluspolyphemus)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、溫室希蛛(Parasteatodatepidariorum)和斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)同源性分別為71.30%、57.38%、63.98%、52.29%和63.46%.EsAQP1氨基酸序列具有AQP1家族成員的所有典型保守特征，包括6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)NPA(Asn-Pro-Ala)結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)保守序列HINPAVT和PLAIGL.

使用MEGA5.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建了AQP1的系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)AQP1序列屬于不同的譜系.EsAQP1的序列首先與三疣梭子蟹、可口美青蟹、斑節(jié)對(duì)蝦等甲殼類動(dòng)物的AQP1序列聚類，然后與其他無脊椎動(dòng)物聚類，最后與脊椎動(dòng)物聚為一支(圖3，第97頁).

圖3 AQP1氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 EsAQP1 mRNA在不同組織中的表達(dá)

中華絨螯蟹EsAQP1基因在其腦、胸神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、肌肉、鰓、腸、心臟、胃和血細(xì)胞中均有表達(dá)(圖4).其中EsAQP1基因在腸道和鰓組織中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是胸神經(jīng)節(jié)和腦稍低，在肝胰腺和血細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄水平最低.

圖4 中華絨螯蟹不同組織中AQP1的mRNA轉(zhuǎn)錄分析

2.4 鹽脅迫對(duì)EsAQP1表達(dá)的影響

不同鹽度脅迫后，中華絨螯蟹腸組織AQP1基因表達(dá)模式的變化如圖5(a)所示.相比于對(duì)照組，高鹽度脅迫0～3h中，EsAQP1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，在6h達(dá)到最低值；接著在12h開始上調(diào)并達(dá)到最高，然后于48h顯著下調(diào)，并在隨后的時(shí)間保持較低的轉(zhuǎn)錄水平量(P<0.05)(圖5(a)).在低鹽度脅迫0～3h中，AQP1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，在6h達(dá)到最低值；接著在6～24h中開始上調(diào)并在24h達(dá)到最高，24～48h下調(diào)，48～72h上調(diào)，72～96h下調(diào)(P<0.05).

不同鹽度脅迫后，中華絨螯蟹鰓組織AQP1基因表達(dá)模式的變化如圖5(b)所示.相比對(duì)照組，在0～3h中，高鹽度脅迫組中EsAQP1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，并在3～12h這個(gè)時(shí)間段保持較低的轉(zhuǎn)錄水平，經(jīng)過24h后，轉(zhuǎn)錄水平開始上調(diào)，隨后一直保持緩慢上升的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05).在低鹽度脅迫中，0～6h，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，隨后于12h開始緩慢上調(diào)(P<0.05).

圖5 EsAQP1基因在鹽度脅迫下的相對(duì)表達(dá)量

2.5 沉默EsAQP1對(duì)NKCC和Na+/K+-ATP的影響

根據(jù)已知序列分別合成了AQP1dsRNA-1、AQP1dsRNA-2、AQP1dsRNA-3、AQP1 dsRNA-4和AQP1dsRNA-5基因片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均能有效干擾AQP1基因的表達(dá).由于AQP1dsRNA-1靠近5’端且避開所有保守序列區(qū)，所以選擇基因片段，同時(shí)為了保證較高的干擾效率，經(jīng)篩選后確定AQP1dsRNA-1的用量為1μL.接著將1μLAQP1dsRNA-1加入培養(yǎng)基中1h，2h，4h和8h后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了鰓組織中滲透壓調(diào)節(jié)基因的表達(dá).與對(duì)照組相比，鰓組織培養(yǎng)2h后NKCC基因表達(dá)顯著上調(diào)，并在4h達(dá)到最大值，然后下降(P<0.05，圖6(a)).利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR來檢測(cè)干擾后不同時(shí)間點(diǎn)鰓組織中Na+/K+-ATP基因的表達(dá)情況.相比于對(duì)照組，Na+/K+-ATP基因的相對(duì)表達(dá)在干擾2h后顯著增加(P<0.05)，并在8h達(dá)到最大值(P<0.05，圖6(b)).

圖6 AQP1干擾片段對(duì)NKCC-mRNA以及Na+/K+-ATP-mRNA表達(dá)量的影響

3 討 論

AQP廣泛分布在動(dòng)植物細(xì)胞膜中，具有水轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)、滲透脅迫響應(yīng)和選擇性離子滲透等功能[17-19].在脊椎動(dòng)物中，已經(jīng)克隆了較多AQPs基因并進(jìn)行了有關(guān)功能驗(yàn)證[20-21].但是在無脊椎動(dòng)物，尤其是在甲殼類動(dòng)物中的有關(guān)研究卻十分有限.在本研究中，從中華絨螯蟹鰓組織中克隆獲得EsAQP1基因，并探討了其組織表達(dá)分布以及鹽脅迫對(duì)其表達(dá)的影響.生物信息學(xué)分析顯示，EsAQP1具有典型的AQPs家族結(jié)構(gòu)，具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)NPA(Asn-Pro-Ala)域和一個(gè)區(qū)段MIP家族的保守序列(HINPAVT).推導(dǎo)的373個(gè)氨基酸多肽序列和結(jié)構(gòu)在甲殼類動(dòng)物中相對(duì)保守，氨基酸序列比對(duì)表明EsAQP1與三疣梭子蟹、可口美青蟹、美洲鱟、羅氏沼蝦、溫室希蛛和斑節(jié)對(duì)蝦的AQP1具有50%～75%的序列相似性[4,13,22].

鰓組織是生物進(jìn)行離子和氣體交換以及滲透壓調(diào)節(jié)等過程的重要組織器官.已有研究表明中華絨螯蟹在生長發(fā)育、繁殖以及遷徙過程中會(huì)通過鰓組織調(diào)節(jié)機(jī)體滲透壓來保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.本研究結(jié)果顯示：中華絨螯蟹EsAQP1基因在鰓中表達(dá)量顯著高于其他組織，說明中華絨螯蟹鰓組織在滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用.此外，EsAQP1基因在腸組織中的表達(dá)水平也顯著高于其他組織，說明中華絨螯蟹腸道也是滲透壓調(diào)節(jié)的重要場(chǎng)所.

王渝等[4]研究發(fā)現(xiàn)：在低鹽度脅迫下三疣梭子蟹鰓組織中AQP1的表達(dá)呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，其在3～12h內(nèi)表達(dá)量保持較低水平，隨后于24～48h開始上調(diào)，這說明水通道蛋白基因在滲透壓調(diào)節(jié)過程可能發(fā)揮重要的作用.An等[10]研究發(fā)現(xiàn)AQP1基因在黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)體內(nèi)的表達(dá)在淡水和海水中呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)：在淡化過程中，鰓和腸中的表達(dá)量最高，腎臟中表達(dá)量較低；在海水中，腎臟中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鰓和腸.在大西洋鮭(Atlanticsalmon)[11]、鳉魚(Fundulusheteroclitu)[23]、日本鰻鱺(Anguillajaponica)[24]等魚中也獲得相似的結(jié)果，在外界鹽度升高時(shí)AQP1表達(dá)量下降以保證機(jī)體滲透壓的平衡[25].當(dāng)外界鹽度下降，AQP1表達(dá)量增加排出多余水分，保證機(jī)體滲透壓穩(wěn)定[11]，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也說明了這一點(diǎn).

研究表明RNA干擾已經(jīng)成功應(yīng)用于斑節(jié)對(duì)蝦、斑馬魚和大鼠等動(dòng)物體內(nèi).特定的干擾片段在干擾過程中起主要作用，目前使用的干擾片段可通過體外轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成等方式獲得[26].RNA干擾技術(shù)因?yàn)槠涓咝院透咛禺愋栽诨蚬δ艿奶剿?、疾病治療等生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[27].而在甲殼類動(dòng)物中，在基因功能的檢測(cè)上也常用到RNA干擾技術(shù)[28].

NKCC是一種電中性離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中均分布十分廣泛.NKCC以1Na+∶1K+∶2Cl-的比例對(duì)離子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在維持細(xì)胞離子平衡、滲透壓調(diào)節(jié)以及機(jī)體形態(tài)等方面發(fā)揮重要作用.鈉鉀泵(Na+/K+-ATP)是一種廣泛存在于細(xì)胞膜上的嵌入式跨膜蛋白，其轉(zhuǎn)運(yùn)模式是通過酶和ATP分子相結(jié)合，這種結(jié)合使酶的結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致膜內(nèi)結(jié)合3個(gè)Na+和膜外結(jié)合2個(gè)K+，這種結(jié)構(gòu)的改變會(huì)使ATP水解釋放能量給酶，酶具有能量后，可使K+進(jìn)到膜內(nèi)，而Na+排出膜外.這種轉(zhuǎn)運(yùn)模式在機(jī)體免疫、能量代謝、滲透壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞離子平衡等很多方面發(fā)揮重要作用[29].研究發(fā)現(xiàn)在擬穴青蟹、日本囊對(duì)蝦、三疣梭子蟹等甲殼類動(dòng)物中NKCC和Na+/K+-ATP基因在鹽度脅迫下被激活，促進(jìn)機(jī)體向外分泌離子，維持機(jī)體滲透壓平衡，保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定.本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)干擾后不同時(shí)間點(diǎn)鰓組織中NKCC基因和Na+/K+-ATP基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量在干擾后均顯著增加.這表明通過干擾AQP1基因的表達(dá)，降低了鰓中細(xì)胞內(nèi)外水的轉(zhuǎn)運(yùn)工作，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外存在滲透壓差，促使鰓中NKCC和Na+/K+-ATP基因上調(diào)，使機(jī)體向胞外排出多余離子而發(fā)揮其功能.本研究通過對(duì)EsAQP1基因的干擾初步探討了其功能，發(fā)現(xiàn)其可能在中華絨螯蟹的滲透壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)中起重要作用.