楊志剛，周俊宇，朱靚亮，成永旭，夏冬梅

(1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；3.福建省水產(chǎn)功能性飼料與養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州 363000)

Na+-K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+-K+-Cl-Cotransporter, NKCC)是一種電中性離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的一員，在脊椎動物和無脊椎動物都有分布.NKCC能以1Na+∶1K+∶2Cl-的比例對離子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，廣鹽性魚類能在不同鹽度脅迫時進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞離子平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞體積，進(jìn)而維持細(xì)胞滲透壓，在惡劣的環(huán)境中繼續(xù)生存[1].研究表明，當(dāng)魚體處于高滲環(huán)境中，其機(jī)體NKCC基因被激活，向體外分泌離子，維持滲透壓平衡[2].NKCC基因的全長序列在底鱂(Fundulusheteroclitus)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)、羅非魚(Oreochromisspp)等被克隆且其表達(dá)隨鹽度變化上調(diào)[3-5].甲殼動物中，在日本囊對蝦(Penaeusjaponicas)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)等中克隆獲得NKCC基因序列，并對其定位和在滲透壓調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行了研究[6-8].

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis,Es)廣泛分布在我國長江中下游的河流和湖泊中，是一種具有增養(yǎng)殖前景的經(jīng)濟(jì)甲殼動物[9]，其具有一整套特殊的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制，能通過調(diào)節(jié)自身滲透壓適應(yīng)外界水體鹽度變化[10-11]，但尚未見全長NKCC基因在中華絨螯蟹個體中功能的報道.本實(shí)驗(yàn)成功克隆獲得在中華絨螯蟹滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能的NKCC全長基因序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，研究高鹽度脅迫下不同時間點(diǎn)NKCC基因的表達(dá)，可為深入研究甲殼動物離子通道與滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制積累基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 材料

從上海海洋大學(xué)崇明基地捕捉體重130g左右的雄性中華絨螯蟹，在水泥池中暫養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn).隨機(jī)選取6只健康個體取后3對鰓用于cDNA克隆，另取腸、腦神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心臟和血清并迅速保存在液氮中用于組織定量表達(dá).

TRIzol Reagen購自Invitrogen公司，2×Taq PCR MasterMix、DNA膠回收試劑盒、RNA保存液和大腸桿菌E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞購買自天根生化科技(北京)有限公司，5×PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq Kit和PMD-19T購自TaKaRa公司，SMARTer?RACE 5’/3’Kit購自Clontech公司.

1.2 引物設(shè)計

以中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組中與NKCC基因高度相似的unigene為模板使用NCBI的Primer-BLAST設(shè)計中間片段擴(kuò)增引物(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).克隆獲得NKCC基因cDNA片段.使用Primer-BLAST分別設(shè)計3’端和5’端擴(kuò)增引物.利用獲得的中華絨螯蟹NKCC基因全長，設(shè)計實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)引物.以中華絨螯蟹18S-RNA基因作為內(nèi)參基因.實(shí)驗(yàn)所有引物(表1)合成以及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列

1.3 中華絨螯蟹NKCC基因全長cDNA的克隆

根據(jù)TRIzol Reagen試劑盒(Invitrogen)說明書提取中華絨螯蟹鰓總RNA.取5μL用于瓊脂糖凝膠電泳(1%質(zhì)量分?jǐn)?shù))檢測，使用紫外分光光度計測定總RNA的質(zhì)量和濃度.根據(jù)PrimeScript RT Master Mix(Cat.No.RR036A, TaKaRa)說明書反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA.使用4對引物對合成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)展.根據(jù)2×Taq PCR MasterMix試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明書中的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測并對符合大小的條帶進(jìn)行回收.根據(jù)天根DNA膠回收試劑盒說明書步驟對產(chǎn)物回收.純化后的片段與PMD-19T(TaKaRa)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限公司).挑取陽性克隆產(chǎn)物進(jìn)行菌液PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)，然后測序.5’和3’RACE分別按照SMARTer?RACE 5’/3’Kit試劑盒(Clontech)配制50μL反應(yīng)體系，根據(jù)說明書步驟進(jìn)行擴(kuò)增.

1.4 生物信息學(xué)分析

利用VecScreen(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)克隆測序的序列在線軟件對克隆測序的序列進(jìn)行去載體，得到目的片段序列，將核心片段和RACE片段拼接獲得中華絨螯蟹NKCC基因cDNA序列全長.利用NCBI ORFfinder在線工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測中華絨螯蟹NKCC基因的開放閱讀框.利用ProParam(http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)和NetNGlyc 1.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì).使用NCBI Protein BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對中華絨螯蟹NKCC進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析.利用DNAMAN和MEGA 5.0軟件對序列進(jìn)行多重比較和構(gòu)建進(jìn)化樹.

1.5 中華絨螯蟹NKCC基因組織表達(dá)分析

通過SYBRPremixExTaqKit試劑盒實(shí)現(xiàn)熒光定量，在ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行.利用10倍梯度稀釋的cDNA模板制作引物的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定模板合適的濃度以及反應(yīng)條件.通過相對標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，當(dāng)退火溫度設(shè)置為62℃，退火時間設(shè)置為45s時，擴(kuò)增引物效率可達(dá)到100%±5%；同時cDNA模板稀釋倍數(shù)為10時，擴(kuò)增Ct值處于合適范圍.取中華絨螯蟹的腸、腦神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心臟和血清進(jìn)行熒光定量，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，每個組織取5個生物學(xué)重復(fù)樣品，每個生物學(xué)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù).根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Kit試劑盒配制反應(yīng)體系.反應(yīng)程序?yàn)閮刹椒≒CR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃ 30s；95℃ 5s，62℃ 45s，共擴(kuò)增40個循環(huán)；溶解曲線分析程序?yàn)椋?5℃ 15s，65℃ 60s，95℃ 30s.采用2-ΔΔCt法用Excel2013軟件分析目的基因的相對表達(dá)量.

1.6 中華絨螯蟹NKCC基因高鹽度不同脅迫時間表達(dá)分析

鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)在上海海洋大學(xué)立架式循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)分為海水組(Sea Water, SW)和淡水組(Fresh Water, FW)，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)20只蟹.SW用海水晶配制水體鹽度為25‰.FW組用曝氣后的自來水，鹽度為0.中華絨螯蟹暫養(yǎng)7d后，挑取健康、附肢完整的個體用于實(shí)驗(yàn).將實(shí)驗(yàn)蟹至于立架式循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的玻璃缸(40cm×40cm×60cm)中，缸底鋪細(xì)沙并放至瓦塊等用于隱蔽.實(shí)驗(yàn)過程中不進(jìn)行投喂，光照周期為12h光照/12h黑暗，每天對水質(zhì)參數(shù)進(jìn)行兩次監(jiān)測，水體溫度保持在24.5～30.0℃，pH值為(8.0±0.4)，ρ(DO)>5mg/L，ρ總氨氮<0.01mg/L.分別取鹽度脅迫0，3，6，12，24，48，72，96，122，144h中華絨螯蟹腸組織和血清，并迅速至于液氮中保存.中華絨螯蟹腸組織進(jìn)行qRT-PCR，18S rRNA基因被用作內(nèi)參基因.使用PrimeScrip RT試劑盒，以1μg RNA為模板合成cDNA第1鏈.qRT-PCR的反應(yīng)體系為10μL 2×SYBR Premix Ex Taq(Cat.No.RR420A; TaKaRa)、0.2μmol/L引物、2μL cDNA模板.反應(yīng)在ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(Life Tech, Applied Biosystems)上進(jìn)行.為減少實(shí)驗(yàn)誤差，每個時間點(diǎn)取3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)做3次技術(shù)重復(fù).

1.7 高鹽度不同脅迫時間中華絨螯蟹血清滲透壓及血清離子變化分析

使用微型勻漿器(T10B，德國IKA公司)對1.6節(jié)中解凍后的血清進(jìn)行勻漿，4000r/min下勻漿2～3min，然后于4℃、12000r/min離心20min，取出上清液備用.取50μL血清用冰點(diǎn)滲透壓測定儀(OSMOMAT 030，德國Gonotec公司)測定血清滲透壓，用超純水將血清稀釋2倍后用電解質(zhì)分析儀(K-Lite5，廣東梅州康立高科有限公司)分別測定Na+、Cl-濃度.

1.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并進(jìn)行Duncan’s多重比較分析各組間差異的顯著性，顯著水平為P<0.05.

2 結(jié) 果

2.1 中華絨螯蟹NKCC基因克隆及序列分析

以中華絨螯蟹NKCC基因cDNA為模板克隆得到全長序列，將測序結(jié)果進(jìn)行拼接對比獲得中華絨螯蟹NKCC基因全長.該基因的cDNA全長為4127bp，其3’端序列長944bp，5’端序列長18bp，ORF序列長3165bp.3’端包含典型的加尾信號序列(AATAAA)和31bp的poly(A)序列.

通過序列分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹NKCC基因的ORF共編碼1054個氨基酸.預(yù)測分子量為116.102kDa，理論等電點(diǎn)為5.87.Leu和Ala含量最高，分別占11.8%和8.0%.總負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)為102個，總正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)為89個，不穩(wěn)定性指數(shù)32.80，證明該蛋白質(zhì)分類為穩(wěn)定的.脂肪族氨基酸指數(shù)為97.89，表明該蛋白具有較高的耐熱性.總平均疏水指數(shù)為0.059，表明該蛋白為疏水蛋白.利用NetNGlyc 1.0預(yù)測顯示中華絨螯蟹NKCC蛋白的N端不存在信號肽，為非分泌蛋白，預(yù)測NKCC為一類跨膜糖蛋白，氨基酸序列中含有10個N-糖基化位點(diǎn)，在胞內(nèi)和胞外區(qū)域均有分布.

利用ProParam預(yù)測該蛋白細(xì)胞定位為細(xì)胞質(zhì)膜，可信度為31%，具有12個跨膜結(jié)構(gòu)域.通過NCBI蛋白質(zhì)BLAST對中華絨螯蟹NKCC氨基酸序列進(jìn)行分析(圖1)，結(jié)果表明在663～1054氨基酸殘基之間有一個典型的Na+-K--Cl-共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC12A結(jié)構(gòu)域.在51～1054氨基酸殘基之間有一個典型的K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域.

圖1 中華絨螯蟹NKCC全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 同源性分析及進(jìn)化樹分析

利用NCBI對中華絨螯蟹NKCC基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLAST，獲得多條與中華絨螯蟹NKCC基因具有較高同源性的其他物種NKCC氨基酸序列，利用DNAMAN對上述氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對分析，比對結(jié)果示于圖2(第88頁).結(jié)果表明：中華絨螯蟹NKCC氨基酸序列與擬穴青蟹NKCC同源性為86.17%，與三疣梭子蟹、可口美青蟹、日本囊對蝦、夏威夷紅蝦(Hawaiian Red Shrimp)和普通濱蟹(Carcinusmaenas)的同源性分別為85.44%，85.77%，77.28%，77.69%和85.92%(圖2).

圖2 中華絨螯蟹NKCC和其他物種NKCC氨基酸序列多重比對

利用MEGA5軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining)將中華絨螯蟹NKCC基因與其他物種的NKCC基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出中華絨螯蟹NKCC首先與擬穴青蟹、三疣梭子蟹、可口美青蟹、藍(lán)蟹聚為一支，再與夏威夷紅蝦和日本囊對蝦聚為一支，而與小鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)等脊椎動物同緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3).

2.3 中華絨螯蟹NKCC基因不同組織表達(dá)分析

中華絨螯蟹NKCC基因在所檢測的腸、腦神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心臟和血清中均有表達(dá).由圖4可以看出，中華絨螯蟹NKCC基因在腸中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)；其次為腦神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、胃、肝胰腺；在肌肉、眼、心臟和血清中的表達(dá)量較低且沒有顯著性差異(P>0.05)(圖4).

圖4 NKCC mRNA在中華絨螯蟹各個組織中的相對表達(dá)量

2.4 高鹽度下不同脅迫時間中華絨螯蟹NKCC基因表達(dá)分析

分析了高鹽脅迫下NKCC基因在中華絨螯蟹腸組織中不同脅迫時間的表達(dá)模式(圖5).研究結(jié)果表明，高鹽脅迫后0～3h，NKCC表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，6h表達(dá)量上升，隨后12～48h，NKCC表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，并在72h顯著上調(diào)(P<0.05)，在96～144h，NKCC表達(dá)量變化不大，但顯著低于0h和72h(P<0.05).

圖5 高鹽度不同脅迫時間NKCC基因表達(dá)分析

2.5 高鹽度下不同脅迫時間中華絨螯蟹血清滲透壓血清離子變化分析

測定了中華絨螯蟹在高鹽脅迫下不同時間Na+，Cl-的含量變化及血清滲透壓變化(圖6，圖7).研究結(jié)果表明，高鹽度脅迫下，中華絨螯蟹血清Na+和Cl-含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.Na+的含量在72h達(dá)到最高然后開始下降，Cl-的含量在24h達(dá)到最高然后開始下降；高鹽度脅迫下，中華絨螯蟹血清滲透壓在0～6h顯著上升(P<0.05)，在6～72h呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，然后再72～144h略有下降，但變化不顯著(P>0.05).

圖6 高鹽度不同脅迫時間血清Na+和Cl-變化

圖7 高鹽度不同脅迫時間血清滲透壓變化

3 討 論

NKCC屬于電中性陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)家族，預(yù)測的中華絨螯蟹NKCC基因序列包含了電中性陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)家族的特征結(jié)構(gòu)域[12-14]，這與日本囊對蝦的研究結(jié)果相似[6].氨基酸序列分析結(jié)果顯示中華絨螯蟹NKCC蛋白的N端不存在信號肽，為非分泌蛋白，該蛋白細(xì)胞定位為細(xì)胞質(zhì)膜.具有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，為一類跨膜糖蛋白，氨基酸序列中含有10個N-糖基化位點(diǎn).已有研究表明，所有NKCC都是糖蛋白[15]，NKCC基因的TM7和TM8的胞外環(huán)具有糖基化位點(diǎn)，而NKCC基因TM7和TM8的胞外環(huán)糖基化與細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能密切相關(guān)[16].本實(shí)驗(yàn)通過RACE技術(shù)和基因克隆技術(shù)克隆成功得到中華絨螯蟹鰓的NKCC基因全長cDNA序列，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，其與甲殼動物NKCC聚為一個分支，與高等脊椎動物明顯分開.通過基因序列比對，發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹NKCC基因與擬穴青蟹、三疣梭子蟹、日本囊對蝦的NKCC基因序列有高度同源性，證明NKCC基因在甲殼動物中高度保守，這與在梭子蟹中的研究結(jié)果相似[11].通過基因序列分析，發(fā)現(xiàn)在639～1054氨基酸殘基之間有一個典型的SLC12A結(jié)構(gòu)域.在51～1054氨基酸殘基之間有一個典型的K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域.

為揭示NKCC基因在中華絨螯蟹中應(yīng)對鹽度脅迫過程中的作用機(jī)制，本研究比較分析了高鹽脅迫處理下中華絨螯蟹各組織中NKCC基因表達(dá)量的變化情況.通過對中華絨螯蟹組織定量分析發(fā)現(xiàn)，NKCC基因在各個組織均有表達(dá)，在腸中表達(dá)量最高，其次是腦神經(jīng)結(jié)，這與日本囊對蝦[6]和羅非魚[5]中NKCC在鰓中的表達(dá)量最高不同.中華絨螯蟹后鰓是離子轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場所，其有許多明顯的離子轉(zhuǎn)運(yùn)上皮超微結(jié)構(gòu)，離子轉(zhuǎn)運(yùn)型上皮有大量的離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，如Na+-K+-ATP酶和V-ATP酶等.這些離子通道通過線粒體供能完成轉(zhuǎn)運(yùn)離子及維持機(jī)體滲透壓穩(wěn)態(tài)[17].中華絨螯蟹NKCC在鰓中的表達(dá)明顯低于腸道，這說明高鹽脅迫對腸道中NKCC基因的表達(dá)影響更為顯著.腸道作為消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，同時也是滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵組織[18]，在應(yīng)對外界刺激的過程中起到至關(guān)重要的作用.在對薩羅羅非魚的滲透壓研究中發(fā)現(xiàn)，薩羅羅非魚在適應(yīng)高鹽度環(huán)境時，水通道蛋白在腸道中的表達(dá)量升高，參與了腸道的水分吸收[19].在對中華絨螯蟹腸道圍食膜的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹圍食膜由上皮細(xì)胞分泌而成，分泌蛋白包含Na+-K+-ATP酶、ATP合酶、肌動蛋白、微管蛋白等，其可能參與免疫、滲透壓調(diào)節(jié)及營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^程[18].本研究中NKCC在中華絨螯蟹腸道中的表達(dá)顯著高于其他組織，說明相對于其他部位，中華絨螯蟹腸道組織發(fā)揮了重要的滲透壓調(diào)節(jié)作用.

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度脅迫時間的延長，中華絨螯蟹血清中的Na+和Cl-先呈現(xiàn)上升趨勢，分別在24h和72h達(dá)到最高水平，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，并在96h后逐漸恢復(fù)穩(wěn)定.相比于對照組而言，中華絨螯蟹血清滲透壓先呈現(xiàn)顯著上升，在72h達(dá)到最高水平，然后有所下降，并在96h后保持穩(wěn)定的趨勢.表明：為應(yīng)對高鹽度脅迫，隨著中華絨螯蟹血清滲透壓的顯著改變，血清Na+和K+濃度也發(fā)生顯著變化，Na+和K+在中華絨螯蟹滲透壓調(diào)節(jié)中具有重要的作用.隨著高鹽度脅迫，中華絨螯蟹腸NKCC基因的表達(dá)量先是在3h內(nèi)顯著下降，并在脅迫48h下降到最低水平，然后在72h其表達(dá)量又顯著上升并逐漸保持穩(wěn)定的趨勢.表明：中華絨螯蟹NKCC能在短時間內(nèi)響應(yīng)外界滲透壓的變化，進(jìn)一步證明其參與了機(jī)體滲透壓的調(diào)節(jié).魚類上的研究表明，NKCC基因有兩個亞型，分別是NKCC1和NKCC2.NKCC1是分泌亞型，在包括滲透調(diào)節(jié)器官在內(nèi)的各個組織中均有表達(dá)，主要向細(xì)胞外分泌離子.NKCC2是吸收亞型，主要在腎臟和腸中表達(dá)，負(fù)責(zé)從外界吸收離子[5].然而，本研究克隆得到的序列信息不足以確定中華絨螯蟹NKCC基因是哪種亞型.其次，甲殼動物是否像高等脊椎動物那樣存在兩種NKCC亞型也尚需要進(jìn)一步研究.