酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)濁米酒中高級(jí)醇含量

袁國(guó)億，王春曉，何宇淋，邱樹(shù)毅

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng),550025)

濁米酒是一種以糯米、大米、紅米或黑米等稻米為主要原料，配合酒曲和水釀造而成的傳統(tǒng)低度發(fā)酵型酒精飲料[1]。濁米酒因在發(fā)酵結(jié)束后不采用過(guò)濾工藝而呈現(xiàn)渾濁的外觀[2]，具有獨(dú)特的風(fēng)味和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受大眾喜愛(ài)[3]。濁米酒發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝產(chǎn)生的高級(jí)醇與米酒風(fēng)味及其安全性息息相關(guān)，高級(jí)醇通常是指碳原子數(shù)超過(guò)2的一元醇類物質(zhì)[4]，主要有異丁醇、異戊醇[5]、苯乙醇[6]、正丙醇[7-8]等，高級(jí)醇是酒體中重要的呈香呈味物質(zhì)，但含量過(guò)高會(huì)使酒體呈現(xiàn)苦味等不良風(fēng)味[9]，且具有較強(qiáng)的致醉性[10]，飲用后會(huì)出現(xiàn)“上頭”和嘔吐等不適癥狀[11-12]，對(duì)人體健康有毒害威脅[13]。據(jù)報(bào)道稱，以糧谷類原料釀制而成的酒，其高級(jí)醇質(zhì)量濃度須控制在0.2 g/100mL以下(以異丁醇、異戊醇計(jì))[9]，而米酒中高級(jí)醇含量相對(duì)高于其他酒種[5,13]，因此，米酒中高級(jí)醇含量的快速精準(zhǔn)檢測(cè)對(duì)控制米酒風(fēng)味品質(zhì)意義重大。

高級(jí)醇的測(cè)定方法主要為氣相色譜法和分光光度法[14-15]：氣相色譜法可準(zhǔn)確分析米酒中單一高級(jí)醇的含量[12]，并以各高級(jí)醇含量之和作為高級(jí)醇總量，但該方法需依賴昂貴的檢測(cè)耗材，如色譜柱等，且后期維護(hù)費(fèi)用較高；分光光度法通常采用2種或2種以上高級(jí)醇的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)代表被測(cè)樣品中高級(jí)醇總含量，它不能準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中單個(gè)高級(jí)醇含量，檢測(cè)相對(duì)耗時(shí)且所需樣品量多(1 mL以上)。酶標(biāo)儀比色法是基于朗伯-比爾定律實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的定量分析的一種檢測(cè)方法[16]，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)研究中[17-18]。與以往研究對(duì)酶標(biāo)儀比色法的評(píng)價(jià)一致[19]，本研究在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)酶標(biāo)儀比色法的主要優(yōu)點(diǎn)為樣品少(200 μL)、通量高(可同時(shí)掃描檢測(cè)96個(gè)樣品)、檢測(cè)速度快(1 s內(nèi)可出掃描結(jié)果)、準(zhǔn)確度高等。本研究采用酶標(biāo)儀比色法建立6種高級(jí)醇(異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇、正丙醇、正丁醇、己醇)定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在單一標(biāo)曲分析和濁米酒氣相檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，建立6種高級(jí)醇不同配比的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以期為濁米酒中高級(jí)醇含量的檢測(cè)提供快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機(jī)糯米，北京和雅堂食品有限公司；α-淀粉酶、糖化酶，北京索萊寶Solarbio公司；血球計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；異丁醇，天津瑞金特化學(xué)品有限公司；異戊醇，成都市科龍化工試劑廠；苯乙醇，上海麥克林生化有限公司；正丙醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；己醇，阿拉丁；無(wú)水乙醇，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸，重慶萬(wàn)盛川東化工有限公司；對(duì)二甲氨基苯甲醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

顯微鏡Ti-s，日本尼康；YXQ-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CT-IFD型潔凈工作臺(tái)、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；IMS-20制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公司；7890A氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫；VARIOSKAN FLASH酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試劑配制

對(duì)二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液(質(zhì)量濃度5 g/L)：取0.25 g對(duì)二甲胺基苯甲醛，用95%～98%的硫酸定容至50 mL。

1 mg/mL單一高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(以異丁醇為例)：稱取0.1 g異丁醇，加入50 mL色譜級(jí)無(wú)水乙醇，用蒸餾水定容至100 mL。

0.1 mg/mL單一高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(以異丁醇為例)：吸取5 mL上述1 mg/mL異丁醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水定容至50 mL。

2種高級(jí)醇在不同體積配比下的組合溶液(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)：組合1，V(正丙醇)∶V(異丁醇)=1∶1；組合2，V(正丙醇)∶V(異戊醇)=1∶1；組合3，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶1；組合4，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶4；組合5，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=2∶1；組合6，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶2。

6種高級(jí)醇(配比順序?yàn)楫愇齑肌帽揭掖肌卯惗〈肌谜肌眉捍肌枚〈?在不同體積配比下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)：配比1為1∶1∶1∶0.6∶0.02∶0.02，配比2為2∶1∶1∶0.6∶0.02∶0.02，配比3為2∶1∶1.5∶0.6∶0.02∶0.02；配比4為1∶1∶0.6∶0.6∶0.02∶0.02；配比5為2∶1∶0.6∶0.6∶0.02∶0.02；配比6為1.5∶1∶0.6∶0.6∶0.02∶0.02。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 米酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取100 g糯米，加蒸餾水浸泡過(guò)夜，將浸泡米用4層紗布過(guò)濾，瀝干后放入500 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。冷卻后加入150 mL無(wú)菌水、1.89 g α-淀粉酶和0.56 g糖化酶，攪拌均勻，在 60 ℃水浴中酶解30 min制成糯米發(fā)酵培養(yǎng)基。將活化后的FBKL2.8022和FBKL2.8023酵母培養(yǎng)于10 mL的麥芽汁培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照1×106個(gè)/mL接種至糯米發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行米酒發(fā)酵，每個(gè)發(fā)酵建立2個(gè)平行。發(fā)酵溫度為30 ℃，每24 h記錄發(fā)酵液重量損失，當(dāng)失重<0.2 g/d即認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。將發(fā)酵液經(jīng)紗布過(guò)濾后取100 mL轉(zhuǎn)移至500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水和5顆玻璃珠進(jìn)行蒸餾并收集餾出液，當(dāng)餾出液達(dá)100 mL時(shí)停止蒸餾，將餾出液保藏于4 ℃冰箱中用于后續(xù)高級(jí)醇含量的檢測(cè)[20]。

1.4.2 氣相色譜法檢測(cè)高級(jí)醇含量

氣相色譜條件：色譜柱DB-FFAP (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度260 ℃，程序升溫到45 ℃保持3 min，以16 ℃/min速率升溫到120 ℃并保持3 min，再以50 ℃/min的速率升溫至220 ℃并保持5 min，F(xiàn)ID檢測(cè)器的檢測(cè)溫度為260 ℃。氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min。進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，分流比為40∶1[12]。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：配制8個(gè)梯度濃度的正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇、苯乙醇和正丁醇的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分標(biāo)樣梯度濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種高級(jí)醇的定量線性關(guān)系[12]。樣品檢測(cè)：吸取2 mL蒸餾后的米酒樣品，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行氣相色譜分析，每個(gè)樣品檢測(cè)3次，用變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)評(píng)估該方法的檢測(cè)精密度。

1.4.3 酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)高級(jí)醇含量

1.4.3.1 酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間研究

目前已有的研究報(bào)道采用比色法檢測(cè)高級(jí)醇時(shí)所用波長(zhǎng)不盡相同，有495[11,21-22]、500[23]、520[24]和425 nm[15]等。本研究按照GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》中4.4雜醇油檢測(cè)步驟建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。利用酶標(biāo)儀測(cè)定了408、450、500和520 nm下1 h內(nèi)的吸光度值，分析所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線R2受檢測(cè)波長(zhǎng)和檢測(cè)時(shí)間的影響。

1.4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

單一標(biāo)準(zhǔn)曲線(0～0.05 mg)的建立：分別吸取0.1 mg/mL的高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL置于10 mL比色管中；各比色管中加蒸餾水至1 mL，搖勻并放入冷水中冷卻，沿管壁緩慢加入2 mL對(duì)二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液，搖勻放入沸水浴中加熱15 min后取出，立即放入冰浴中冷卻并加入2 mL蒸餾水混勻[14]。使用酶標(biāo)儀于特定波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，建立高級(jí)醇質(zhì)量與吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。單一標(biāo)準(zhǔn)曲線(0～1 mg)的建立：分別吸取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.02、0.05、0.2、0.5、0.75、1 mL置于10 mL比色管中，后續(xù)步驟與上述一致?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)曲線(0～0.05 mg)的建立操作步驟與同質(zhì)量范圍內(nèi)單一標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟一致，區(qū)別在于吸取的高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液組成不同。根據(jù)2.2中氣相色譜法對(duì)濁米酒中高級(jí)醇含量的檢測(cè)結(jié)果，設(shè)置了6種配比關(guān)系(如1.2中所述)，建立每一種配比條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，為酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)米酒中高級(jí)醇含量提供線性依據(jù)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建的線性方程中，擬合度R2是反應(yīng)變量之間相關(guān)系數(shù)密切程度的指標(biāo)，通常認(rèn)為擬合度>0.99時(shí)所構(gòu)建的線性方程線性較好。

1.4.3.3 樣品檢測(cè)

吸取1.0 mL蒸餾后的米酒樣品加蒸餾水定容至10 mL，混勻后吸取0.30 mL置于10 mL比色管中，后續(xù)操作與2.2中標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建時(shí)所用步驟一致。米酒樣品中雜醇油的含量按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：X，試樣中雜醇油質(zhì)量濃度，g/100mL；m，測(cè)定試樣稀釋液中雜醇油的質(zhì)量，mg；V2，試樣體積，mL；V1,測(cè)定用試樣稀釋體積，mL；

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜法檢測(cè)濁米酒中高級(jí)醇含量

采用氣相色譜外標(biāo)法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線除苯乙醇的R2為0.99以上外，其他高級(jí)醇的R2均達(dá)到0.999以上，線性可靠(表1)。定量檢測(cè)FBKL2.8022發(fā)酵的米酒樣品中6種高級(jí)醇質(zhì)量濃度為277.75 mg/L(表2)，其中，異戊醇、苯乙醇、異丁醇和正丙醇為發(fā)酵米酒中主要的4種高級(jí)醇，異戊醇、苯乙醇、異丁醇、正丙醇、己醇、丁醇之間的比例接近配比2。定量檢測(cè)FBKL2.8023發(fā)酵的米酒樣品中6種高級(jí)醇質(zhì)量濃度為169.66 mg/L(表2)，異戊醇、苯乙醇、異丁醇和正丙醇為發(fā)酵米酒中主要的4種高級(jí)醇，異戊醇、苯乙醇、異丁醇、正丙醇、己醇、丁醇之間的比例接近配比4或配比6。除FBKL2.8023發(fā)酵米酒樣品中的苯乙醇外，檢測(cè)其他高級(jí)醇的變異系數(shù)均<10%，說(shuō)明該方法精密度較高，重現(xiàn)性較好[24]。

表1 高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(氣相色譜法)Table 1 Standard curves of higher alcohols established by gas chromatography method

表2 濁米酒中高級(jí)醇含量(氣相色譜法)Table 2 Higher alcohols content in turbid rice wine detected by gas chromatography method

2.2 酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)濁米酒中高級(jí)醇含量

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間確定

如圖1-a所示，4種檢測(cè)波長(zhǎng)下1 h內(nèi)所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2受檢測(cè)時(shí)間的影響較小，受檢測(cè)波長(zhǎng)影響較大，其中520 nm時(shí)繪制的1 h內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均>0.99，明顯高于其他檢測(cè)波長(zhǎng)獲得的R2，因此本研究選定520 nm為酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)高級(jí)醇含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。如圖1-b所示，在520 nm處，吸光度受檢測(cè)時(shí)間的影響較小，0～15 min內(nèi)吸光度輕微下降，15 min之后趨于穩(wěn)定，因此本研究選定15 min為酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)高級(jí)醇含量的檢測(cè)時(shí)間。

a-不同波長(zhǎng)和時(shí)間獲取的R2值變化曲線;b-520 nm檢測(cè)吸光度隨檢測(cè)時(shí)間變化曲線圖1 酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)波長(zhǎng)及時(shí)間的確定Fig.1 The determination of measurement wavelength and time in the colorimetric method of microplate reader

2.2.2 高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在0～0.05 mg的低質(zhì)量范圍內(nèi)(表3，圖2-a)，異丁醇、異戊醇、己醇的線性較好，線性擬合度均>0.99；苯乙醇、正丁醇線性較差，但在此范圍內(nèi)其吸光度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，即測(cè)定酒體中高級(jí)醇總含量時(shí)，苯乙醇和正丁醇的存在可能會(huì)影響其他高級(jí)醇含量的最終測(cè)定；正丙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎完全重合于X軸，與空白對(duì)照數(shù)據(jù)相差不大，即在此質(zhì)量范圍內(nèi)正丙醇的存在可能不會(huì)影響到其他高級(jí)醇含量的測(cè)定。但在0～1 mg的高質(zhì)量范圍內(nèi)(表3，圖2-b)，正丙醇和苯乙醇擬合度明顯提高，異丁醇、異戊醇和苯乙醇的線性擬合度均達(dá)到0.99以上。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)(表3)，單一高級(jí)醇在不同質(zhì)量范圍內(nèi)呈現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程斜率差異較大，因此建立標(biāo)曲前需根據(jù)具體樣品中高級(jí)醇的濃度范圍建立對(duì)應(yīng)質(zhì)量范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中高級(jí)醇的濃度范圍可通過(guò)氣相色譜外標(biāo)法或酶標(biāo)儀比色法來(lái)確定。

為進(jìn)一步分析正丙醇對(duì)濁米酒中主要高級(jí)醇含量檢測(cè)的影響，本研究分別建立了正丙醇與異丁醇或異戊醇在1∶1的配比條件下0～0.05 mg的標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3，圖2-c)。結(jié)果表明正丙醇與異丁醇1∶1的混合標(biāo)曲線性較好(R2=0.995 4)，而正丙醇與異戊醇1∶1的混合標(biāo)曲線性較差(R2=0.862 1)，此外，2組混合標(biāo)曲的線性方程的斜率均明顯不同于異丁醇和異戊醇在相同質(zhì)量范圍內(nèi)的單一標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，單一正丙醇在0～0.05 mg雖然沒(méi)有呈現(xiàn)明顯吸光度值，但與異丁醇或異戊醇1∶1混合后會(huì)影響對(duì)2種高級(jí)醇質(zhì)量的檢測(cè)。

采用分光光度法測(cè)定酒體中高級(jí)醇通常是以異丁醇和異戊醇體積之和表示，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶4[18]、V(異丁醇)∶V(異戊醇)=2∶5[23]等，因此，本研究建立了異丁醇與異戊醇在4種不同配比下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3，圖2-c)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丁醇和異戊醇配比為1∶1和2∶1時(shí)所建標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率接近于異丁醇在同質(zhì)量范圍內(nèi)的單一標(biāo)曲，而當(dāng)異丁醇和異戊醇配比為1∶2和1∶4時(shí)所建標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率接近于異戊醇在同質(zhì)量范圍內(nèi)的單一標(biāo)曲，并且線性擬合度隨異丁醇占比的增加而提高，隨異戊醇占比的增加而下降。因此，建立混合標(biāo)曲前需根據(jù)具體樣品中不同高級(jí)醇的濃度范圍建立對(duì)應(yīng)配比的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中不同高級(jí)醇的質(zhì)量濃度范圍可通過(guò)氣相色譜外標(biāo)法或酶標(biāo)儀比色法來(lái)確定。

根據(jù)氣相色譜法對(duì)FBKL2.8022和FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒中高級(jí)醇含量的檢測(cè)結(jié)果，本研究共建立了6條不同高級(jí)醇配比的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3，圖2-d)，每一條標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度均達(dá)到0.99以上，其中配比2達(dá)到0.999以上，說(shuō)明線性關(guān)系較好。平均值標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3，圖2-d)根據(jù)配比1到配比6的平均吸光度值建立，其斜率接近配比1和配比5。此外，F(xiàn)BKL2.8022發(fā)酵濁米酒中6種高級(jí)醇的比例接近于本研究設(shè)定的標(biāo)曲2，而FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒中6種高級(jí)醇的比例接近于本研究設(shè)定的標(biāo)曲4和標(biāo)曲6。6條不同高級(jí)醇配比的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的差異進(jìn)一步說(shuō)明了所需檢測(cè)樣品中不同高級(jí)醇含量配比對(duì)酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)結(jié)果的影響，因此，需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品中不同高級(jí)醇的質(zhì)量濃度范圍來(lái)選擇準(zhǔn)確的混合標(biāo)曲進(jìn)行樣品檢測(cè)分析。

2.2.3 濁米酒中高級(jí)醇含量檢測(cè)

本研究采用酶標(biāo)儀比色法根據(jù)3.2.1建立的檢測(cè)條件分析FBKL2.8022和FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒中高級(jí)醇的含量，檢測(cè)到FBKL2.8022吸光度為0.042 233 667，F(xiàn)BKL2.8023吸光度為0.018 592 8，標(biāo)準(zhǔn)偏差均<0.001 5，變異系數(shù)均<3.1%，說(shuō)明酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)精密度高，重現(xiàn)性好。根據(jù)6條不同配比標(biāo)準(zhǔn)曲線和平均值標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得發(fā)酵濁米酒中高級(jí)醇總量如表4所示，本研究采用配比接近樣品的混合標(biāo)曲進(jìn)行6種高級(jí)醇含量的計(jì)算，因此配比2標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算FBKL2.8022發(fā)酵濁米酒，各組分高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.06%～3.94%，而配比4用于計(jì)算FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒，各組分高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.72%～1.58%。酶標(biāo)儀比色法和氣相色譜法檢測(cè)同一米酒樣品時(shí)，酶標(biāo)儀比色法對(duì)各組分高級(jí)醇的檢測(cè)結(jié)果略高于氣相色譜法(圖3)，采用軟件SPSS 21.0中單因素方差分析進(jìn)行2種檢測(cè)方法的差異顯著性統(tǒng)計(jì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，樣品為FBKL2.8022發(fā)酵濁米酒時(shí)單一高級(jí)醇和高級(jí)醇總量的P值均<0.05，說(shuō)明差異顯著，而樣品為FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒時(shí)單一高級(jí)醇和高級(jí)醇總量的P值均>0.05，說(shuō)明差異不顯著，由表4可知導(dǎo)致FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒檢測(cè)方法差異不顯著的主要原因可能是發(fā)酵平行樣品的酶標(biāo)儀比色法的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。

a-6種高級(jí)醇0～0.05 mg單一標(biāo)準(zhǔn)曲線；b-4種高級(jí)醇0～0.1 mg單一標(biāo)準(zhǔn)曲線；c-2種高級(jí)醇不同配比0～0.05 mg混合標(biāo)準(zhǔn)曲線；d-6種高級(jí)醇不同配比0～0.05 mg混合標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2 酶標(biāo)儀比色法建立的單一和混合高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curves of single and mixed higher alcohols established by the colorimetric method of microplate reader

表3 高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(酶標(biāo)儀比色法)Table 3 Standard curves of higher alcohols established by colorimetric method of microplate reader

表4 濁米酒中高級(jí)醇含量(酶標(biāo)儀比色法)Table 4 Higher alcohols content in turbid rice wine detected by the colorimetric method of microplate reader

圖3 酶標(biāo)儀比色法和氣相色譜法對(duì)濁米酒中高級(jí)醇含量檢測(cè)對(duì)比Fig.3 Comparison of the higher alcohols content in turbid rice wine examined by the colorimetric method of microplate reader and gas chromatography

3 結(jié)論與展望

采用酶標(biāo)儀比色法測(cè)定濁米酒中高級(jí)醇含量的最佳檢測(cè)條件為520 nm、15 min，此條件下建立的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，而在單一標(biāo)曲中正丙醇、苯乙醇、正丁醇標(biāo)準(zhǔn)曲線線性稍差，但擬合度會(huì)隨質(zhì)量范圍增加而得到改善。通過(guò)配比2和配比4對(duì)應(yīng)混合標(biāo)曲所檢測(cè)的濁米酒中高級(jí)醇質(zhì)量濃度高于氣相色譜法的檢測(cè)結(jié)果，這可能與酒樣中除異丁醇、異戊醇、苯乙醇、正丙醇、正丁醇、己醇外還存在其他高級(jí)醇而引起顯色效果加深有關(guān)，這一推論還需進(jìn)一步的檢測(cè)來(lái)證實(shí)。

分光光度法測(cè)高級(jí)醇通常以V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶4 來(lái)表示[14]，但在實(shí)際情況中，由于酒體中不僅只含有異丁醇和異戊醇，其他高級(jí)醇的存在也會(huì)影響檢測(cè)吸光度值，因此此法不能準(zhǔn)確分析濁米酒中高級(jí)醇總含量。針對(duì)不同濁米酒樣品，可以通過(guò)氣相色譜法摸索樣品中主要高級(jí)醇的比例，建立該比例下酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此檢測(cè)高級(jí)醇含量。根據(jù)本研究結(jié)果，酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)結(jié)果受不同高級(jí)醇含量的影響較大，且無(wú)法直接檢測(cè)濁米酒中單一高級(jí)醇含量。進(jìn)一步的研究需要解決酶標(biāo)儀比色法對(duì)不同高級(jí)醇的定性分析，這對(duì)于采用酶標(biāo)儀比色法快速檢測(cè)濁米酒品質(zhì)具有重要意義。