黃麗芬，韋落落，田思思，段云波，喬自林，李 鈾，2*

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730100；

2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅蘭州 730030）

貴德黑裘皮羊是我國青藏高原地區(qū)藏羊的特殊經(jīng)濟類型，主要分布在我國青海省貴南縣，以產(chǎn)黑紫羔二毛皮而聞名[1]。貴德黑裘皮羊所產(chǎn)出的羔皮皮板堅韌、輕軟、毛色烏黑發(fā)亮、毛質(zhì)細膩、毛辮不易黏結(jié)、毛卷花緊實美觀，呈環(huán)狀或半環(huán)彎曲狀，是我國裘用羊羔皮中的珍品[2]。在20 世紀(jì)80 年代中期，引進其他品種的羊與貴德黑裘皮羊進行雜交，導(dǎo)致品種優(yōu)質(zhì)資源純度下降，羔羊皮的品質(zhì)也隨之下降。種質(zhì)資源的下降曾一度讓貴德黑裘皮羊面臨絕種的危險[3]。因此，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多次將貴德黑裘皮羊確定為國家級遺傳資源保護品種，2014 年頒布的《中國國家級畜禽遺傳資源保護名錄》確定159 個畜禽品種為國家級畜禽遺傳資源保護品種，貴德黑裘皮羊名列其中[4]。因此，對貴德黑裘皮羊進行群體系統(tǒng)發(fā)育的分析，對今后開展貴德黑裘皮羊遺傳育種及資源保護和合理利用工作具有重要意義。

線粒體DNA（mtDNA）是動物細胞唯一一種核外遺傳物質(zhì)，與核內(nèi)DNA相比，分子量較小、進化速度較快、不與組蛋白結(jié)合而裸露并具有嚴(yán)格的母系遺傳、突變率高等特點。線粒體的這些特點對于研究動物遺傳關(guān)系及起源進化十分有利[5]。很多研究者對貴德黑裘皮羊進行分子方面的研究[6-8]。其中，基于線粒體DNA的研究數(shù)量較少，且主要以線粒體D-loop 區(qū)和Cytb 基因為擴增對象，其他線粒體基因在貴德黑裘皮羊系統(tǒng)進化方面的研究應(yīng)用較少[6,9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)羊線粒體DNA 的COI 基因含有的遺傳物質(zhì)具有很強的系統(tǒng)解析能力，主要用于屬、種級系統(tǒng)發(fā)育的研究[10]。但還未有學(xué)者利用此基因?qū)F德黑裘皮羊進行系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究基于線粒體COI 基因?qū)F德黑裘皮羊進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并探討其與其他品種綿羊的遺傳關(guān)系，為后續(xù)貴德黑裘皮羊的保種工作及資源合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究中使用的貴德黑裘皮羊樣本來自西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心的動物細胞保藏庫，共選取樣本5支，樣本信息見表1。

表1 樣本信息Tab.1 Sample information

1.2 基因組DNA的提取及DNA濃度檢測

使用常規(guī)方法將凍存細胞進行復(fù)蘇培養(yǎng)后，采用通用型基因組DNA 提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）對細胞進行基因組DNA的提取，使用Qubit 4對所提取的基因組DNA進行濃度檢查。

1.3 引物與PCR擴增

以Genbank中綿羊mtDNA（序列號為AF010406）全序列為基礎(chǔ)，進行引物的設(shè)計。所設(shè)計的上游引物為COIF（5'-ACAGTCGGAATAGACGTCGA-3'），下 游 引 物 為COIR（5'-GGTTCTTCAAATGTGTGGTATGG-3'）。引物由寶生物工程（大連）公司合成。利用所設(shè)計的引物對貴德黑裘皮羊進行線粒體COI基因序列的擴增。試驗前，通過不斷的試驗，建立最佳的PCR 擴增體系，此次擴增體系（25 μL）：上下游引物為0.5 μL 和10 μmol/L、DNA 2 μL、2×Pro Taq Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；最后72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳，在136 V 電壓下跑膠30 min 進行檢測。檢測合格的擴增產(chǎn)物送蘭州天啟基因生物科技有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

獲得測序結(jié)果用Geneious 11.0.4 處理原始測序文件，將2 條序列的波峰進行拼接得到比較完整序列的波峰圖，并對完整的樣本序列波峰圖進行校對，最終生成Fasta 文件格式獲得單個樣本的完整序列。所得貴德黑裘皮羊COI 基因序列與Genbank 上已發(fā)表的其他綿羊品種的COI 基因序列用MEGA-X 處理，所用綿羊品種信息見表2。

表2 Genbank上已發(fā)表的綿羊品種信息Tab.2 Sheep breed information published on the Genbank

計算貴德黑裘皮羊種內(nèi)及貴德黑裘皮羊與其他綿羊品種間的遺傳距離，構(gòu)建ML進化樹、NJ進化樹，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。選用p-disdtance作為模型構(gòu)建NJ進化樹進行遺傳距離的計算。運用MEGA軟件中的MODELS功能對構(gòu)建ML 進化樹的最佳模型進行計算。通過計算，查看序列數(shù)據(jù)的BIC值（BIC值表示的是模型對數(shù)據(jù)的解釋度，BIC值越小則表示模型對數(shù)據(jù)的解釋力越強），并選取BIC值最低的模型作為最佳模型進行ML樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因擴增測序結(jié)果

將檢測合格的PCR 擴增產(chǎn)物送由蘭州天啟基因生物科技有限公司進行測序，測序結(jié)果顯示擴增序列長度合適，為所擴增目標(biāo)基因序列，經(jīng)過序列拼接校對后得到的序列長度均為622 bp，整理后的結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)GD-3 樣本在622 bp處發(fā)生單核苷酸變異，堿基A突變?yōu)閴A基T，其他樣本序列均未發(fā)生突變。

2.2 貴德黑裘皮羊基于COI基因系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA將經(jīng)Geneious11.0.4軟件拼接校對后的貴德黑裘皮羊COI序列與在GenBank上下載的52個序列，用鄰近法（見圖1）和最大似然法（見圖2）進行貴德黑裘皮羊系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建。

圖1 NJ系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree

圖2 ML系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Maximum Likelihood phylogenetic tree

由圖1 可知，基于COI 基因用鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹可看出貴德黑裘皮羊品種之間，樣本GD-1、GD-4、GD-5距離較近，樣本GD-2和GD-3與其他3個樣本距離較遠，但都聚在同一支上。同時，試驗選用的5個貴德黑裘皮羊樣本個體COI 基因序列與烏珠穆沁羊、灘羊、青海藏羊、塔什庫爾干羊等18個品種的羊聚為一支，說明所試驗貴德黑裘皮羊與這18個綿羊品種有較近的親緣關(guān)系；也說明所采集到的貴德黑裘皮羊樣本有可能與這18個親緣關(guān)系較近的品種的羊存在基因流。結(jié)果顯示，貴德黑裘皮羊與蒙古盤羊、西藏盤羊、芬蘭綿羊等34個國際羊的品種沒有聚在同一支上，有較遠的親緣關(guān)系。其中，親緣關(guān)系最遠的是蒙古盤羊、西藏盤羊。

基于COI基因序列先運用MEGA軟件中MODELS功能計算，找到構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)生樹的最佳模型Tamura 3-parameter，進而利用最大似然法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹。由圖2可知，結(jié)果與鄰近法所建的系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果相差不大，顯示貴德黑裘皮羊樣本仍與烏珠穆沁羊、灘羊、青海藏羊等18 個國際上的綿羊品種聚為一支，樣本GD-2與樣本GD-1、GD-4、GD-5距離較近，樣本GD-3卻與其他4個樣本有一定差異，說明該樣本與其他綿羊品種存在基因流，可能是品種間雜交導(dǎo)致。

3 討論

mtDNA 在生物體內(nèi)會隨著線粒體獨立復(fù)制，不受核基因影響，不與組蛋白結(jié)合而裸露，具有嚴(yán)格的母系遺傳特點，且拷貝數(shù)遠遠高于核DNA。核基因會隨著待檢樣本的變質(zhì)腐蝕而降解，但樣本仍可通過PCR 擴增技術(shù)對mtDNA進行擴增檢測，且與核基因相比，mtDNA擴增更容易[11]。mtDNA 較核基因有較低的突變率，mtDNA 在一些區(qū)段變異較快，而基于母系遺傳的特點在另一區(qū)段可能相對保守。同時，母系遺傳的特點使其不受外來雜交公畜基因的影響，并且保留好進化過程中的變異位點，能夠在系統(tǒng)進化研究中更好地提供遺傳材料[12]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)mtDNA 的COI 基因含有的遺傳物質(zhì)具有很強的系統(tǒng)解析能力，適用于屬、種間的遺傳進化關(guān)系研究，有不少研究利用其進行物種遺傳進化的研究并取得一定成果。徐浩文等[13]經(jīng)過對8個地理種群紅條毛膚石鱉COI基因進行擴增研究遺傳多樣性，得到南方與北方的紅條毛膚石鱉群體遺傳多樣性存在差異，應(yīng)該對2個地區(qū)的紅條毛膚石鱉分別進行相對應(yīng)的保護措施。趙慶等[14]利用COI 基因分析我國重要的貝類之間的系統(tǒng)進化關(guān)系，研究表明，COI 基因能對不同區(qū)域的同一種群進行聚類，驗證COI基因在物種系統(tǒng)進化研究中的可行性。但是，目前尚未見到對貴德黑裘皮羊進行COI基因擴增研究其系統(tǒng)進化關(guān)系的報道。

因此，本次試驗經(jīng)過反復(fù)試驗，選取PCR 最優(yōu)反應(yīng)體系對貴德黑裘皮羊線粒體DNA的COI基因進行擴增。因核苷酸序列數(shù)據(jù)屬于性狀數(shù)據(jù)，不能夠通過核苷酸序列來研究物種的進化距離，所以得到的擴增結(jié)果經(jīng)測序及Geneious11.0.4軟件校對處理后需要用軟件將核苷酸序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為種群個體之間的距離值，再進行分析[15]。本試驗結(jié)果顯示，貴德黑裘皮羊樣本之間均聚為一支，但GD-3與其他樣本GD-1、GD-2、GD-4、GD-5 有一定的親緣距離。同時，在參與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建的GenBank 上下載的52 個品種羊中，與貴德黑裘皮羊聚為一支的共有18 個品種，與貴德黑裘皮羊有較近的親緣關(guān)系，可以初步判斷所采集貴德黑裘皮羊樣本有可能與國際上其他綿羊品種進行了雜交，且樣本GD-3 個體與其他親緣關(guān)系相對較遠品種的羊進行了雜交。其余34個國際上的綿羊品種都沒有與貴德黑裘皮羊品種聚為一支，與貴德黑裘皮羊有較遠的親緣關(guān)系，其中親緣關(guān)系較遠的是蒙古盤羊和西藏盤羊。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，貴德黑裘皮羊種質(zhì)資源的保護應(yīng)避免其與其他綿羊品種之間的基因流。未來研究工作應(yīng)利用多基因、多手段的分析方法，系統(tǒng)、全面地揭示貴德黑裘皮羊種群遺傳情況與系統(tǒng)進化關(guān)系，為其種質(zhì)資源遺傳保護提供可靠的參考依據(jù)。