張超 王平 劉愛峰 張君濤 李遠(yuǎn)棟

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科300380

0 引 言

機(jī)械敏感性離子通道（mechanosensitiveion ion channels，MSCs）是活細(xì)胞表面的機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)電信號(hào)或化學(xué)信號(hào)時(shí)主要的機(jī)械感受器，并與細(xì)胞骨架一起構(gòu)成機(jī)械感受器體系[1-3]。力學(xué)傳導(dǎo)是細(xì)胞接受和轉(zhuǎn)化力學(xué)刺激為生物信號(hào)的過程，對(duì)器官發(fā)育和大量生理活動(dòng)有重要意義[4]。近年來，在真核生物中，Piezo 蛋白作為機(jī)械激活陽離子通道逐漸成為研究熱點(diǎn)。而骨關(guān)節(jié)是與力學(xué)直接相關(guān)的組織，機(jī)械力傳導(dǎo)及引起細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)對(duì)骨科疾病的治療和預(yù)防非常重要，基于此，本文就有關(guān)Piezo 機(jī)械敏感性離子通道在骨與關(guān)節(jié)領(lǐng)域的研究進(jìn)行綜述。

1 Piezo 機(jī)械敏感性離子通道的發(fā)現(xiàn)

2010 年，Coste 等[5]在斯克里普斯研究所發(fā)現(xiàn)了兩種無特殊功能的老鼠蛋白，這種蛋白表現(xiàn)出機(jī)械傳感器的特性，他們將這兩種具有高度相似序列的蛋白質(zhì)命名為Piezo1 和Piezo2（“Piezo”在希臘語表示壓力或擠壓）。Piezo 蛋白是離子通道的成孔狀亞基單位，其在力學(xué)刺激下開放，可使帶正電的陽離子包括Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)[6]。當(dāng)受到力學(xué)激活時(shí)，這兩種蛋白都可獨(dú)立地誘導(dǎo)陽離子非選擇性電流。在不同的物種中，Piezo 都是非常大的蛋白質(zhì)（人類Piezo1 和Piezo2分別為2521 和2752 個(gè)氨基酸），每個(gè)蛋白有多個(gè)亞基的預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與已知的其他蛋白質(zhì)沒有明顯的同源性。已經(jīng)證實(shí)Piezo 同源蛋白存在于許多真核生物中，大多數(shù)脊椎動(dòng)物都有Piezo1 和Piezo2 兩種通道亞型[5,7]。Piezo1 和Piezo2在人體的不同器官和組織中表達(dá)，如大腦、視神經(jīng)、牙周韌帶、背根神經(jīng)節(jié)和皮膚、肺、心血管系統(tǒng)和紅細(xì)胞、腸胃系統(tǒng)平滑肌、骨組織及關(guān)節(jié)軟骨等。對(duì)比兩種類型的壓電通道，結(jié)果表明[8]，Piezo2 具有較快的動(dòng)力學(xué)，通常介導(dǎo)快速的膜反應(yīng)，而Piezo1 通道的特征是較慢的動(dòng)力學(xué)。因此Piezo2 更適合于檢測(cè)瞬態(tài)機(jī)械力，而Piezo1 可對(duì)更持久的機(jī)械力作出反應(yīng)。

2 Piezo 蛋白離子通道的結(jié)構(gòu)與功能

雖然Piezo 蛋白通道的整體結(jié)構(gòu)和門控機(jī)制仍未知，但GeJ 等[9]通過低溫電子顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的Piezo1 蛋白是一個(gè)三聚體螺旋槳樣結(jié)構(gòu)，胞外結(jié)構(gòu)域類似三個(gè)遠(yuǎn)端葉片和一個(gè)中央帽，每個(gè)亞單位的跨膜區(qū)域有14 個(gè)節(jié)段，中心孔包圍一個(gè)潛在的離子導(dǎo)電孔，這種三聚體結(jié)構(gòu)使Piezo1 可利用其外圍區(qū)域作為力傳感器為中心的離子導(dǎo)電孔提供通道。這種類似于機(jī)械原理的結(jié)構(gòu)使其將力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)信號(hào)成為可能。與Piezo1 蛋白結(jié)構(gòu)類似，Wang 等[10]通過低溫電子顯微鏡結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，Piezo2也是一個(gè)三聚體螺旋槳樣機(jī)構(gòu)，包括114 個(gè)跨膜螺旋，跨膜螺旋1-36 疊成9 個(gè)串聯(lián)單元，每個(gè)單元由4 個(gè)跨膜螺旋組成，形成非平面葉片。三個(gè)葉片共同彎曲成一個(gè)直徑為28 nm、深度為10 nm 的穹隆，細(xì)胞外帽狀結(jié)構(gòu)嵌入在中心，中心孔與細(xì)胞內(nèi)9 nm 長(zhǎng)的光束相連。

Piezo1 和Piezo2 兩種機(jī)械門控離子通道參與了生命所必需的各種生理功能，Piezo1 在小鼠血管系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要作用，Piezo2 在感知觸覺、疼痛、呼吸和血壓方面起著關(guān)鍵作用[11-13]。Piezo 離子通道主要功能為感知并傳導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力包括細(xì)胞刺激、膜擴(kuò)張、基底偏轉(zhuǎn)或流體流動(dòng)等。Moroni 等[14]研究表明，除了感知機(jī)械力學(xué)刺激，Piezo蛋白通道也受電壓變化的調(diào)控，甚至可切換到純電壓門控模式。他們認(rèn)為壓電通道的電壓敏感性是一種深層特性，在不同的細(xì)胞環(huán)境中增加了壓電激活的調(diào)節(jié)機(jī)制。

3 Piezo 蛋白離子通道的抑制劑與激動(dòng)劑

通常情況下，離子通道都會(huì)有其激動(dòng)劑和抑制劑，Piezo 離子通道也不例外。革蘭氏機(jī)械毒素4（Grams mechanotoxin4,GsMTx4）是一種抑制非選擇性陽離子機(jī)械敏感性離子通道的抑制劑，Piezo 通道的發(fā)現(xiàn)也開啟了GsMTx4 研究的一個(gè)新時(shí)代，因?yàn)镻iezo1 在不同的細(xì)胞類型之間表達(dá)，并被GsMTx4 特異性阻斷抑制[15]。Lee 等[16]的研究結(jié)果揭示了Piezo1和Piezo2 在軟骨細(xì)胞的力學(xué)環(huán)境中是高表達(dá)的，同時(shí)使用Piezo 通道抑制劑GsMTx4 作用后可降低軟骨細(xì)胞的凋亡率。Evans 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Yoda1 能激活Piezo1 通道的開放，但對(duì)Piezo2 通道卻沒有激動(dòng)效應(yīng)。Roh 等[18]研究表明，Piezo1 mRNA 和蛋白在小鼠和人背根神節(jié)（dorsal root god，DRG）神經(jīng)元中有表達(dá)，而且Yoda1 通過促進(jìn)鈣內(nèi)流激活Piezo1 蛋白。他們通過采用腺病毒血清型2/5 介導(dǎo)的shRNA 轉(zhuǎn)染小鼠DRG 神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染下調(diào)了piezo1 mRNA表達(dá)，在相同的DRG 神經(jīng)元中，Piezo1 也具有瞬態(tài)受體電位香草樣1（TRPV1）的生理功能，并受小鼠DRG 感覺神經(jīng)元TRPV1 的激活調(diào)節(jié)。由此可知GsMTx4 和Yoda1分別是Piezo1 通道的抑制劑和激動(dòng)劑。

4 Piezo 蛋白離子通道在骨組織中的研究

骨骼系統(tǒng)是一個(gè)不斷適應(yīng)力學(xué)刺激的動(dòng)態(tài)組織。骨細(xì)胞雖然被基質(zhì)包埋，但所有骨細(xì)胞都會(huì)暴露并受到宏觀和微觀力學(xué)環(huán)境的影響，這些因素會(huì)潛在地影響其活性和功能。Piezo 通道是壓電家族的機(jī)械激活離子通道之一，近年來有報(bào)道稱，它在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中起著力學(xué)傳感器的作用。Hendrickx 等[19]通過在成骨細(xì)胞（Runx2Cre）或破骨細(xì)胞（Lyz2Cre）中靶向敲除Piezo1 或Piezo2 基因，發(fā)現(xiàn)在Piezo1 缺失的成骨細(xì)胞中的小鼠存在嚴(yán)重骨質(zhì)疏松和大量自發(fā)性骨折。這種表型發(fā)生在出生后的早期，主要影響繼發(fā)性海綿狀體的形成。通過對(duì)初級(jí)成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)Piezo1 在軟骨內(nèi)成骨中的關(guān)鍵功能以及在骨重塑中起重要作用，表明Piezo1 是治療骨骼疾病非常重要的靶點(diǎn)。Sun 等[20]也認(rèn)為Piezo1 在骨形成中發(fā)揮重要作用，他們通過研究，發(fā)現(xiàn)敲除成骨細(xì)胞中的Piezo1 會(huì)破壞成骨細(xì)胞的成骨過程，從而嚴(yán)重?fù)p害骨結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度。通過模擬微重力治療能抑制Piezo1 的表達(dá)而降低成骨細(xì)胞的功能。在骨質(zhì)疏松癥患者中Piezo1 表達(dá)減少，這與成骨細(xì)胞的功能障礙密切相關(guān)。Li 等[21]通過在體外培養(yǎng)骨細(xì)胞，用流體剪切應(yīng)力刺激發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞是通過Piezo1 感知和響應(yīng)力學(xué)負(fù)荷變化，而小分子激動(dòng)劑對(duì)Piezo1 的刺激能復(fù)制液體流動(dòng)對(duì)骨細(xì)胞的影響。在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中有條件地敲除Piezo1 基因則顯著降低了小鼠的骨量和骨強(qiáng)度，證實(shí)Piezo1 是一個(gè)機(jī)械敏感離子通道。這些數(shù)據(jù)均表明，Piezo1 作為一個(gè)關(guān)鍵的機(jī)械敏感通道，可能會(huì)成為骨質(zhì)疏松癥或力學(xué)丟失引起骨量減少的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

5 Piezo 蛋白離子通道在關(guān)節(jié)軟骨組織中的研究

軟骨本質(zhì)上是一種力學(xué)敏感的組織，軟骨細(xì)胞作為唯一的細(xì)胞類型，在關(guān)節(jié)負(fù)重過程中不斷暴露于不同的力學(xué)環(huán)境中。作為力學(xué)敏感細(xì)胞，軟骨細(xì)胞能感知和反應(yīng)負(fù)荷誘導(dǎo)的刺激，并有序地調(diào)節(jié)其代謝活動(dòng)以維持軟骨內(nèi)環(huán)境平衡。因此，力學(xué)傳導(dǎo)在軟骨細(xì)胞中非常重要，Piezo 離子通道在軟骨功能中的作用至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中機(jī)械敏感通道Piezo1 和Piezo2 可穩(wěn)健表達(dá)。與單壓電表達(dá)相比，Piezo1 和Piezo2 的聯(lián)合定向表達(dá)更能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞機(jī)械誘導(dǎo)的鈣離子信號(hào)和電流的通過。Lee 等[16]也對(duì)軟骨細(xì)胞中Piezo 通道（均為Piezo1 和Piezo2）的存在和功能進(jìn)行了表征，通過采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄和免疫染色技術(shù)對(duì)分離的初級(jí)軟骨細(xì)胞和膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示Piezo1 和Piezo2 均有表達(dá)。當(dāng)軟骨細(xì)胞中的Piezo1 和Piezo2 的表達(dá)基因沉默后，軟骨細(xì)胞就沒有了這種力學(xué)反應(yīng)。Sauter等[22]研究發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈?zhǔn)菣C(jī)械損傷引起軟骨細(xì)胞死亡的關(guān)鍵，撞擊傷引起的軟骨細(xì)胞死亡很大程度上取決于線粒體細(xì)胞骨架的聯(lián)系。

楊騏寧等[23]通過建立人軟骨細(xì)胞體外退變性應(yīng)激刺激模型，采用多通道細(xì)胞拉伸應(yīng)力加載系統(tǒng)X-4000T 治療軟骨細(xì)胞。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，加載頻率為0.5 Hz 時(shí)，其細(xì)胞伸長(zhǎng)率為20%。按細(xì)胞處理時(shí)間可分為0、2、12、24、48 h 機(jī)械應(yīng)激組。使用RT-PCR和Western-blot 檢測(cè)Piezo1 的表達(dá)，并使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)Piezo1 的熒光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人類退變軟骨細(xì)胞中，新的機(jī)械敏感離子通道Piezo1蛋白有微量表達(dá)，施加周期性機(jī)械拉力后，壓電蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間增加而增大。Du 等[24]研究結(jié)果表明軟骨細(xì)胞可通過不同的機(jī)械敏感離子通道感知區(qū)分不同強(qiáng)度的重復(fù)機(jī)械刺激。其研究發(fā)現(xiàn)TRPV4主要負(fù)責(zé)感知重復(fù)性循環(huán)拉伸應(yīng)變（cyclic tensile strains，CTS）生理性刺激，而Piezo2 主要負(fù)責(zé)感知重復(fù)性CTS 過度負(fù)荷水平，他們認(rèn)為Piezo 通道介導(dǎo)的機(jī)械通道可能會(huì)成為治療損傷性、重復(fù)性力學(xué)刺激所致的骨性關(guān)節(jié)炎的一種方法。

6 Piezo 蛋白離子通道在骨髓組織中的研究

骨髓組織的間充質(zhì)干細(xì)胞是目前再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，干細(xì)胞定向分化成骨細(xì)胞需要很多條件，通過對(duì)力學(xué)環(huán)境的感知反應(yīng)是很重要的方面。Sugimoto等[25]通過研究，首次證明Piezo1 通道作為間充質(zhì)干細(xì)胞系（mesenchymal stem cells，MSCs）中靜水壓力（hydrostatic pressure，HP）的受體發(fā)揮功能并促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)能抑制脂肪細(xì)胞分化。通過RT-PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Piezo1 mRNA 在誘導(dǎo)分化小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 中有表達(dá)。通過研究HP 對(duì)MSCs細(xì)胞命運(yùn)決定的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HP 促進(jìn)骨分化的作用主要是依賴于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Piezo1 調(diào)控的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的表達(dá)完成。通過研究發(fā)現(xiàn)，作為Piezo1 的激活劑，HP 和Yoda1 促進(jìn)了BMP2 的表達(dá)和成骨細(xì)胞分化，同時(shí)抑制了脂肪細(xì)胞的分化。而作為抑制劑GsMTx4 可降低成骨細(xì)胞分化和BMP2 表達(dá)。

7 Piezo 蛋白離子通道在椎間盤組織中的研究

椎間盤的退變離不開力學(xué)環(huán)境的改變，作為其中的髓核細(xì)胞在椎間盤的發(fā)病中起到非常重要的作用。Li 等[26]通過RT-PCR、免疫熒光、免疫組織化學(xué)、碘化丙啶分析等研究發(fā)現(xiàn)，人髓核細(xì)胞中高度表達(dá)的是Piezo1 蛋白離子通道。在異常負(fù)荷條件椎間盤退變患者中，Piezo1 蛋白可能通過對(duì)調(diào)節(jié)線粒體功能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與人髓核細(xì)胞的凋亡。同時(shí)也證實(shí)GsMTx4 阻斷人髓核細(xì)胞的Piezo1 蛋白通道與細(xì)胞骨架密切相關(guān)。Yang 等[27]通過轉(zhuǎn)染shRNAPiezo1 干擾載體，建立離體髓核細(xì)胞力學(xué)拉伸應(yīng)力模型干擾其表達(dá)。采用RT-PCR 和Western blot 方法分別測(cè)定了Piezo1 蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，張力組細(xì)胞質(zhì)鈣含量顯著增加（P＜0．05），shRNA干擾組細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯低于拉伸應(yīng)力組（P＜0．05）；與空白對(duì)照組相比，拉伸應(yīng)力處理可導(dǎo)致線粒體膜電位周轉(zhuǎn)率顯著升高（P＜0．05）；而shRNA 干擾組線粒體膜電位翻轉(zhuǎn)率顯著低于拉伸應(yīng)力組（P＜0．05），他們認(rèn)為ShRNA-Piezo1 通過降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和線粒體膜電位的變化對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。這些研究均說明Piezo 通道參與介導(dǎo)了髓核細(xì)胞的退變凋亡，證實(shí)針對(duì)該通道的阻斷或干預(yù)可作為一種治療椎間盤疾病的新方法。

8 Piezo 蛋白離子通道與骨科疾病

戈登綜合征或3 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮是一種罕見的常染色體顯性疾病，其發(fā)病特征是上肢和下肢攣縮，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)戈登綜合征與Piezo2 基因的雜合突變有關(guān)。該基因的不同突變還會(huì)導(dǎo)致5 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲和馬登-沃克綜合征。這種離子通道的功能障礙可影響人體關(guān)節(jié)、眼肌和骨骼的發(fā)育。Alisch 等[28]通過對(duì)病例研究，發(fā)現(xiàn)很多患者往往表現(xiàn)出多個(gè)關(guān)節(jié)的攣縮以及包括上瞼下垂在內(nèi)的明顯的面部表型；此外，還會(huì)伴隨著輕度智力障礙和精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲癥是一組臨床和遺傳學(xué)上的異質(zhì)性疾病，包括多個(gè)先天性肢體攣縮，至少10 個(gè)臨床亞型。Li 等[29]通過對(duì)兩個(gè)中國(guó)患者輕度遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲癥的家庭采用TPM2、TNNI2/TNNT3、TNNC2 附近的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行兩點(diǎn)連鎖分析，繪制疾病位點(diǎn)圖，應(yīng)用PCR 限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性和生物信息學(xué)分析來鑒定兩個(gè)家系的致病突變，結(jié)果在第1 家TPM2 中發(fā)現(xiàn)一個(gè)雜合錯(cuò)義突變，在第2 家Piezo2 中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的突變。TPM2 突變的類型和位置與臨床特征沒有相關(guān)性，不同的遺傳模式和突變類型會(huì)引起不同的臨床表現(xiàn)。當(dāng)Piezo2 缺乏會(huì)引起脊柱關(guān)節(jié)畸形，當(dāng)畸形進(jìn)展時(shí)，需要手術(shù)矯正，以避免神經(jīng)功能缺損和吸障礙[29-30]，由此可見Piezo 通道對(duì)人體的重要性。在骨肉瘤研究方面，Jiang 等[31]通過采用RT-PCR 和western-blotting 檢測(cè)人骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）細(xì)胞中Piezo1 蛋白的表達(dá)。采用CCK-8、Transwell 實(shí)驗(yàn)和AV-PI 檢測(cè)細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡，結(jié)果Piezo1蛋白離子通道在OS 細(xì)胞中高度表達(dá)。通過shRNA抑制了Piezo1 的表達(dá)，2 h 牽張組的Piezo1 表達(dá)量略高于0 h 牽張組，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），凋亡基因Bax、BAD、caspase-3、caspase-9 與在拉伸力作用下表達(dá)的Piezo1 具有相同的特征。通過在裸鼠體內(nèi)對(duì)Piezo1 的侵襲進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)shRNA 能夠抑制OS 細(xì)胞的侵襲。證實(shí)了Piezo1 通道在OS 細(xì)胞中的作用，其與細(xì)胞凋亡、侵襲和增殖的關(guān)系。Piezo1 蛋白可能是一種新的、有潛力的OS 治療靶點(diǎn)。在疼痛方面有研究認(rèn)為剪切應(yīng)力和動(dòng)脈血流變化可能會(huì)激活Piezo 通道導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)生[32]，針對(duì)該通道的研究可能為有效控制包括偏頭痛和慢性疼痛在內(nèi)的相關(guān)疾病開辟一條新的道路。

9 結(jié)語與展望

Piezo 蛋白離子通道屬于目前機(jī)械敏感性離子通道中研究的熱點(diǎn)，本文對(duì)其來源、結(jié)構(gòu)、功能等進(jìn)行系統(tǒng)回顧，重點(diǎn)闡述其在骨組織、軟骨組織、椎間盤、骨髓組織等常見骨科疾病方面的研究進(jìn)展。通過分析研究認(rèn)為Piezo 機(jī)械敏感性離子通道在未來很有可能成為治療骨關(guān)節(jié)疾病的新靶點(diǎn)。但是如何實(shí)現(xiàn)該通道在骨科領(lǐng)域發(fā)揮作用需要進(jìn)一步進(jìn)行研究，尤其是在成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、髓核細(xì)胞等通過Piezo 離子通道感受力學(xué)信號(hào)后，究竟如何通過下游通路實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)方面尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突