【作 者】蔡瑤，付文竹，付央，郭麗，徐加發(fā)

1 江蘇省藥品監(jiān)督管理局審評中心，南京市，210002

2 廣東省藥品監(jiān)督管理局審評認(rèn)證中心，廣州市，510080

3 江蘇碩世生物科技股份有限公司，泰州市，225300

0 引言

參考區(qū)間研究和臨床評價(jià)（此臨床評價(jià)概念包含臨床試驗(yàn)，下同）是第二和第三類體外診斷試劑性能研究的重要內(nèi)容，經(jīng)確定的參考區(qū)間對于臨床評價(jià)具有重要指導(dǎo)意義，臨床評價(jià)過程反過來也會檢驗(yàn)參考區(qū)間的合理性。雖然研究重點(diǎn)和方法不同，但兩者相互聯(lián)系，相互支撐。目前企業(yè)在產(chǎn)品研發(fā)、臨床評價(jià)及注冊過程中，往往忽略參考區(qū)間確定和臨床評價(jià)之間的協(xié)同作用，導(dǎo)致資料前后無法相互印證，甚至有時(shí)相互矛盾。

1 參考區(qū)間的建立

定量體外診斷試劑的參考區(qū)間是參考下限和上限之間的值。某些情況只有其中一個(gè)參考限有意義，常為參考上限（x），則其參考區(qū)間為0～x[1]。

CLSI C28-A3指南中指出：參考區(qū)間建立首先需根據(jù)明確的標(biāo)準(zhǔn)選擇參考個(gè)體，所有參考個(gè)體組成參考人群，然后對參考人群進(jìn)行抽樣，得到可代表參考人群的參考樣本組，通過觀察或測量參考樣本組中的參考個(gè)體而得到參考值，這些參考值的分布情況形成參考分布[1]。根據(jù)被測物的臨床意義和產(chǎn)品預(yù)期用途，確定參考分布的某一個(gè)或幾個(gè)值為參考限，常見情形是以參考分布的單側(cè)（95%）或雙側(cè)（2.5%和97.5%）百分位數(shù)為參考限，比如某些被測物濃度過高和過低均提示身體異常，一般以參考分布的2.5%和97.5%百分位數(shù)為參考下限和上限；若參考區(qū)間分組，則各組也有各自的參考限形成的亞組參考區(qū)間。

從參考區(qū)間的獲得過程可以看出，參考人群和參考樣本組是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的總體和抽樣樣本組的關(guān)系。參考人群是一個(gè)符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的總體，參考樣本組是從參考人群抽樣得到的能代表參考人群的抽樣樣本組，而參考區(qū)間來自抽樣樣本組，因此設(shè)置參考人群的標(biāo)準(zhǔn)不同，參考區(qū)間也必然會有差異[2]。參考區(qū)間可用于區(qū)分個(gè)體的健康狀況，也可提示人體處于不同生理或病理過程[3]。選擇參考個(gè)體時(shí)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途設(shè)置相應(yīng)的參考人群標(biāo)準(zhǔn)，這對于臨床評價(jià)中目標(biāo)人群的選定具有指導(dǎo)意義。

需注意，不同被測物因預(yù)期用途不同而參考個(gè)體的選擇標(biāo)準(zhǔn)通常不同。某被測物排除的個(gè)體可能是其他被測物納入的參考個(gè)體，即使相同的被測物如具有不同的預(yù)期用途，其參考個(gè)體的選擇標(biāo)準(zhǔn)也不同。比如常規(guī)C反應(yīng)蛋白為非特異性炎癥輔助診斷指標(biāo)，其參考個(gè)體的選擇標(biāo)準(zhǔn)一般為非炎癥患者；而超敏C反應(yīng)蛋白在臨床上主要用于評價(jià)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，其參考個(gè)體的選擇標(biāo)準(zhǔn)一般為非心血管疾病患者。目前很多項(xiàng)目在進(jìn)行參考區(qū)間研究時(shí)，往往傾向于選擇年輕健康的個(gè)體作為參考個(gè)體。若被測物受年齡影響，則易導(dǎo)致從年輕健康人群中獲得的參考區(qū)間與目標(biāo)人群的實(shí)際參考區(qū)間差異較大，這種差異會在臨床評價(jià)中引入較大的偏倚。

獲得產(chǎn)品參考區(qū)間的常用方法之一是建立參考區(qū)間。如已有國家或國際公認(rèn)參考區(qū)間，則可直接獲得參考區(qū)間，此時(shí)需重點(diǎn)關(guān)注檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。通常在確定新被測物、不同的人群或新分析方法（比如新方法有更優(yōu)的靈敏度和特異性）的參考值時(shí)，需要建立參考區(qū)間。此外如已建立的參考區(qū)間不適用或與新產(chǎn)品差異較大，也應(yīng)建立相應(yīng)的參考區(qū)間。

確定參考上限/下限的兩種統(tǒng)計(jì)方法為參數(shù)法和非參數(shù)法，前者要求檢測值或經(jīng)轉(zhuǎn)化后符合正態(tài)分布，后者無此要求。目前有些項(xiàng)目在建立參考區(qū)間的過程中缺乏對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，而直接采用參數(shù)法計(jì)算參考區(qū)間，容易導(dǎo)致得到的參考區(qū)間與實(shí)際情況差異較大。多數(shù)情況為從參考樣本組獲得的數(shù)據(jù)并不符合或無法轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布，因此非參數(shù)法是建立參考區(qū)間更為推薦的方法。但不管采用哪種方法，統(tǒng)計(jì)學(xué)上要求至少120例樣本才能達(dá)到參考區(qū)間的90%置信限。

參考區(qū)間是否分組需要考慮不同組的參考值差異，對臨床判斷的影響，以及產(chǎn)品預(yù)期用途對分組的要求等。當(dāng)目標(biāo)人群分層時(shí)需要對參考區(qū)間進(jìn)行分組，每組應(yīng)不少于120例樣本。比如檢測血清和尿液樣本的β2微球蛋白，不同樣本類型的參考值有顯著差異，需要制定各自的參考區(qū)間；又如孕酮因不同性別、年齡段、生理周期中的水平差異較大，如果產(chǎn)品預(yù)期用途涵蓋了對不同人群的輔助診斷，建議提供各人群的參考區(qū)間。

2 參考區(qū)間的驗(yàn)證

建立可靠的參考區(qū)間是一項(xiàng)巨大且耗時(shí)耗力的工作，因此參考區(qū)間驗(yàn)證也是確定參考區(qū)間的常用方法。此方法采用相對較少的參考個(gè)體，將已建立的參考區(qū)間轉(zhuǎn)移到另一項(xiàng)研究中，使得該參考區(qū)間在新的情況下使用?；谧钤紖⒖贾笛芯康暮侠硇约僭O(shè)，參考區(qū)間轉(zhuǎn)移需要重點(diǎn)考慮分析系統(tǒng)和參考人群的可比性。分析系統(tǒng)的可比性主要包括樣本采集和處理（如樣本類型、采集部位、采集和儲存時(shí)間、抗凝劑）、分析方法和使用儀器（如采用的校準(zhǔn)品及校準(zhǔn)方法、儀器的性能參數(shù)）等；參考人群的可比性主要包括性別和年齡、地域分布、用藥狀態(tài)、飲食習(xí)慣等。如果不同方法間具有可比性，那么參考人群間的差異是參考區(qū)間驗(yàn)證的主要影響因素。參考區(qū)間驗(yàn)證采用參考個(gè)體進(jìn)行評估和驗(yàn)證，這些參考個(gè)體來自接收該參考區(qū)間的參考人群，將檢測結(jié)果與原始參考值進(jìn)行對比。如果兩個(gè)分析系統(tǒng)之間差異較大，或者目標(biāo)人群差異大，則不適用通過這種方法獲得參考區(qū)間。

參考區(qū)間驗(yàn)證的核心問題是參考個(gè)體/人群的一致性。驗(yàn)證應(yīng)建立在參考個(gè)體/人群擁有較為一致的背景信息的基礎(chǔ)上，這對臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)中目標(biāo)人群的確定具有十分重要的意義。而目標(biāo)人群最終體現(xiàn)在產(chǎn)品的預(yù)期用途上，這是所有體外診斷試劑在產(chǎn)品設(shè)計(jì)開發(fā)及臨床運(yùn)用中要重點(diǎn)考慮的因素。參考區(qū)間驗(yàn)證也是臨床機(jī)構(gòu)常用方法，具體可參考相關(guān)文件[4]。

3 臨床評價(jià)

《體外診斷試劑注冊管理辦法》規(guī)定：申請人或者備案人可以通過臨床文獻(xiàn)資料、臨床經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)、臨床試驗(yàn)等信息對產(chǎn)品是否滿足使用要求或者預(yù)期用途進(jìn)行確認(rèn)[5]。臨床評價(jià)是對產(chǎn)品臨床性能進(jìn)行的系統(tǒng)性研究，是對產(chǎn)品預(yù)期用途進(jìn)行確認(rèn)必不可少的工作。具體的操作方法可根據(jù)國家藥監(jiān)局發(fā)布的文件要求進(jìn)行[6-7]。

根據(jù)選擇的比較對象不同，臨床評價(jià)可分為與診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的比較研究及與已上市產(chǎn)品的比較研究。有的“金標(biāo)準(zhǔn)”為單一確定標(biāo)準(zhǔn)，如組織病理學(xué)檢查、影像學(xué)檢查、病原體分離培養(yǎng)鑒定等，主要是基于客觀的證據(jù)；有的為采用多種方法或方式綜合判斷，如長期隨訪，結(jié)合患者病史、臨床癥狀、多種檢測結(jié)果等，這實(shí)質(zhì)上是綜合多種客觀資料盡量降低主觀判斷帶來的誤差。

對于與已上市產(chǎn)品比較的臨床評價(jià)中對照試劑的選擇問題，選擇對照試劑的一個(gè)重要原則是選擇最合適的而非最優(yōu)的。既要考慮已上市產(chǎn)品種類多，質(zhì)量參差不齊的情況，也要充分考慮對照試劑在諸如方法學(xué)、預(yù)期用途、性能指標(biāo)、校準(zhǔn)品溯源、參考區(qū)間等方面的差異。因?yàn)榕R床評價(jià)目的是證明考核試劑和對照試劑等效，如果雙方的性能相差較大或預(yù)期用途不同，那么證明兩者等效的出發(fā)點(diǎn)可能就是錯誤的。另外如果在臨床前研究時(shí)發(fā)現(xiàn)對照試劑的質(zhì)量與考核試劑差異明顯，這種情況更推薦采用與方法學(xué)更具有優(yōu)勢的產(chǎn)品或者與“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行對比。

4 參考區(qū)間與臨床評價(jià)的關(guān)系

在臨床實(shí)踐中參考區(qū)間往往是臨床醫(yī)生對檢測值做出正常/異常判斷的標(biāo)準(zhǔn)之一，為臨床診斷提供參考。參考區(qū)間研究和臨床評價(jià)必須緊扣產(chǎn)品預(yù)期用途。參考區(qū)間研究來自參考人群，代表了多數(shù)參考個(gè)體的被測物的濃度范圍。當(dāng)對某受試者進(jìn)行檢測，檢測值落在參考區(qū)間外，提示該受試者的身體可能存在異常。參考區(qū)間研究中所確定的參考人群即為產(chǎn)品預(yù)期用途中所描述的目標(biāo)人群。臨床評價(jià)是對產(chǎn)品預(yù)期用途進(jìn)行確認(rèn)的過程，也可以理解為在真實(shí)的臨床環(huán)境中對目標(biāo)人群進(jìn)行檢測，并結(jié)合參考區(qū)間從而確定產(chǎn)品能準(zhǔn)確識別或提供信息幫助區(qū)分正常和異常人群。

前文提到的與已上市產(chǎn)品對比的臨床評價(jià)，雖然這類研究是證明申報(bào)產(chǎn)品與對照產(chǎn)品等效，但是申報(bào)產(chǎn)品依據(jù)其參考區(qū)間做出的臨床判斷與樣本臨床背景的符合性也應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注，這種符合性在與“金標(biāo)準(zhǔn)”對比的臨床評價(jià)中往往是評價(jià)產(chǎn)品是否能實(shí)現(xiàn)預(yù)期用途的標(biāo)準(zhǔn)之一。

以與“金標(biāo)準(zhǔn)”對比的臨床評價(jià)為例，納入的受試者包含已經(jīng)明確了的正常人群和異常人群，根據(jù)參考區(qū)間對納入的受試者的檢測值進(jìn)行正?；虍惓５呐袛?，之后評估該判斷與受試者的臨床背景信息或臨床診斷是否有較好的符合性。因此，研究得到的參考區(qū)間一定要適用相應(yīng)的臨床評價(jià)，即符合產(chǎn)品預(yù)期用途，防止在臨床評價(jià)過程出現(xiàn)基于參考區(qū)間的評價(jià)結(jié)果與受試者的臨床背景的一致性較低的情況（如從A人群中獲得參考區(qū)間用于判斷B人群，導(dǎo)致過多的正常受試者被判定為異常）。

5 對參考區(qū)間研究和臨床評價(jià)的建議

（1）溯源性。影響參考區(qū)間的因素除了參考人群外，產(chǎn)品的定值溯源也是重要因素。不同溯源產(chǎn)品的檢測結(jié)果是否具有可比性是值得商榷的，如果同類產(chǎn)品來自不同的定值溯源，那么相同檢測數(shù)值代表的量可能是不同的。在實(shí)際檢測過程中表現(xiàn)為對同一樣本進(jìn)行檢測，不同產(chǎn)品的檢測結(jié)果相差較大。這種情況下即使是相同參考人群，各自得到的參考區(qū)間也可能相差較大。因此在臨床評價(jià)選擇對照產(chǎn)品的過程中須考慮校準(zhǔn)品的溯源情況。現(xiàn)實(shí)中可能存在無法獲得對照產(chǎn)品溯源信息的情況，建議盡量選擇性能指標(biāo)等接近的對照產(chǎn)品，同時(shí)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)的檢測量值來做進(jìn)一步的評估。

（2）預(yù)期用途。在開展參考區(qū)間研究和臨床評價(jià)之前，首先應(yīng)明確產(chǎn)品預(yù)期用途。產(chǎn)品預(yù)期用途決定了這兩項(xiàng)研究應(yīng)該如何開展。產(chǎn)品預(yù)期用途包括目標(biāo)人群（如成年人、兒童；性別；疾病史；藥物治療史等）、使用環(huán)境（如家用、臨床機(jī)構(gòu)使用）、樣本類型及要求（如尿液、血清；空腹采集；抗凝劑）、檢測結(jié)果的預(yù)期使用（如診斷疾病、指導(dǎo)用藥、提示損傷、預(yù)后監(jiān)測）等。

產(chǎn)品預(yù)期用途決定了參考區(qū)間研究的參考人群，進(jìn)而決定了參考區(qū)間適用的目標(biāo)人群。預(yù)期用途也決定了臨床評價(jià)中納入的受試者，反過來也可以理解為臨床評價(jià)在哪類受試者中進(jìn)行了確認(rèn)，那么即代表產(chǎn)品將來適用于相應(yīng)的目標(biāo)人群。例如用于檢測成年人群空腹全血的產(chǎn)品，其參考區(qū)間和臨床評價(jià)均應(yīng)采用成年人空腹全血樣本。又如補(bǔ)體C3檢測試劑臨床評價(jià)納入的受試者均為癌癥患者，而該產(chǎn)品的預(yù)期用途為主要用于補(bǔ)體低下或免疫缺陷性疾病的輔助診斷，這樣的受試者顯然缺乏代表性，臨床評價(jià)考察的人群與產(chǎn)品的預(yù)期用途不符。再如用于輔助診斷新型冠狀病毒肺炎患者的核酸檢測試劑，在臨床實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，針對的目標(biāo)人群主要是《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中明確的疑病例類型，比如有密切接觸史，發(fā)熱和/或呼吸道癥狀；具有上述肺炎影像學(xué)特征；發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)正常或降低，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少等，但據(jù)了解，目前有很多無相應(yīng)癥狀的受試者亦被納入臨床試驗(yàn)中作為目標(biāo)人群，這顯然是不合適的[8]。

（3）分組設(shè)計(jì)。參考區(qū)間的分組與臨床評價(jià)之間有著密切聯(lián)系。參考區(qū)間分組主要考慮以下幾點(diǎn)：第一，各個(gè)參考值之間的差異較大，是否影響預(yù)期用途的實(shí)現(xiàn)。造成參考值的差異的來源有多種，比如年齡、性別、樣本類型（比如用于多種樣本類型檢測的產(chǎn)品）、樣本取樣時(shí)間（比如檢測血糖的產(chǎn)品）、生理周期和妊娠周期（比如檢測性激素的產(chǎn)品）等。在目前很多的產(chǎn)品中，不同樣本類型中同一目標(biāo)物的濃度差異很大，這種情況下，很有必要分別進(jìn)行參考區(qū)間的研究，同時(shí)在臨床評價(jià)中也應(yīng)有相應(yīng)的樣本驗(yàn)證。第二，根據(jù)預(yù)期用途的不同來確定是否需要分組。比如用于檢測空腹和餐后2 h血糖的產(chǎn)品，參考區(qū)間分組為空腹血糖的參考區(qū)間和餐后2 h的參考區(qū)間，臨床評價(jià)也相應(yīng)在這兩種受試者中進(jìn)行評估。第三，臨床上會遇到一些比較特殊的群體（例如孕婦或嬰幼兒），其檢測值通常與正常人不同，如臨床上用到的PCT，新生兒出生時(shí)的PCT含量往往很高[9]，如果僅根據(jù)常人的參考區(qū)間很容易誤診。再如C反應(yīng)蛋白，在懷疑嬰幼兒有炎癥感染時(shí)，臨床上常用指尖全血檢測C反應(yīng)蛋白，結(jié)合白細(xì)胞計(jì)數(shù)等血常規(guī)指標(biāo)來輔助診斷是細(xì)菌感染還是病毒感染以及感染的嚴(yán)重程度。而指尖全血屬于末梢血，應(yīng)考慮獨(dú)立的參考區(qū)間。

參考區(qū)間與臨床評價(jià)作為體外診斷試劑上市前研究的兩個(gè)重要研究內(nèi)容，兩者相互印證、相輔相成。在產(chǎn)品預(yù)期用途的確定、參考人群的選擇、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的運(yùn)用等方面均存在著密切聯(lián)系。無論是參考區(qū)間研究還是臨床評價(jià)研究，最終的落腳點(diǎn)都是臨床實(shí)際中的產(chǎn)品預(yù)期用途。根據(jù)設(shè)定的預(yù)期用途，結(jié)合參考區(qū)間確定過程中需要考慮的因素及方法，在臨床評價(jià)中遵循臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的同時(shí)，也應(yīng)嚴(yán)格按照設(shè)定的參考標(biāo)準(zhǔn)來對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。只有這樣才能真正科學(xué)、客觀地評價(jià)產(chǎn)品的分析性能和臨床性能，真正能夠用于指導(dǎo)臨床診斷、治療等過程，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的臨床價(jià)值。