高效液相色譜法同時(shí)測定食品中10 種人工合成色素含量的研究

郭占魁

（山東新佳祥檢測技術(shù)有限公司，山東 濰坊，261000）

根據(jù)功能不同，食品添加劑可以分為多種類別，如防腐劑、著色劑、增稠劑等。許多食品生產(chǎn)企業(yè)為了引起人們對食品味道的不同聯(lián)想［1］，使用色素將生產(chǎn)的食品進(jìn)行著色。色素，根據(jù)其來源不同，可以分為天然色素和人工合成色素。與天然色素相比，人工合成色素因其成本低廉、著色力強(qiáng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。但是人工合成色素卻不能為人體生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，違規(guī)使用甚至可能會危害人體健康［2-7］。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）對人工合成色素的使用范圍及最大允許添加量［8］進(jìn)行了明確的規(guī)定。而目前仍有不法商販超限量及非法使用人工合成色素，因此，建立一種能快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測人工合成色素的測定方法具有十分重要的意義。

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35-2016）中規(guī)定了飲料、配制酒、硬糖、蜜餞、淀粉軟糖、巧克力豆及著色糖衣制品中的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅的測定［9］，并未涉及到靛藍(lán)、誘惑紅和酸性紅的測定，中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1743-2006 中只規(guī)定了糖果、飲料中誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的檢測［10］，GB/T 21916-2008 中只規(guī)定了水果罐頭中檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅等8 種人工合成色素的高效液相色譜測定方法［11］。雖然文獻(xiàn)［12-18］報(bào)道了幾種合成色素的檢測方法，但很少有同時(shí)測定食品中檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅、誘惑紅、酸性紅等10 種色素的相關(guān)報(bào)道。本文研究確立了一種采用高效液相色譜法進(jìn)行定性定量分析，同時(shí)測定食品中10 種人工合成色素的方法，該方法可適用于多種食品（熟肉制品、速凍食品、粉絲粉條等），具有檢出限低、方法靈敏度高、分離效率好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-2030C 3D 高效液相色譜儀（日本島津，配二極管陣列檢測器），RV10C-S096 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA），3K15 冷凍離心機(jī)（SiGmA），BSM-520.3 電子天平（上海卓精電子科技有限公司），MS205DU 電子天平（梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司），GT-2120QTS 智能超聲波清洗機(jī)（廣東固特超聲股份有限公司），ProElut PWA-2 固相萃取小柱（150 mg/6 mL）（迪馬科技）

1.2 試劑

95%乙醇（AR，煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司）、乙腈（HPLC，美國天地TEDIA）、氨水（GR，國藥集團(tuán)）、甲酸（HPLC，天津大茂化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（HPLC，飛世爾Fisher）、乙酸銨（HPLC，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、色素提取液A：140 mL 乙醇乙腈混合液（V:V=2:1），加入60 mL 水和2 mL 氨水混合制成。實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈水（濰坊娃哈哈飲料有限公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

檸檬黃（92.5%，德國DrEhrenstorfer GmbH）、新紅（89.0%，德國DrEhrenstorfer GmbH）、莧菜紅（92.8%，德國DrEhrenstorfer GmbH）、靛藍(lán)（90.0%，曼哈格）、胭脂紅（89.8%，德國DrEhrenstorfer GmbH）、日落黃（90.5%，德國DrEhrenstorfer GmbH）、誘惑紅（97.9%，曼哈格）、酸性紅（95.4%，德國DrEhrenstorfer GmbH）、亮藍(lán)（91.6%，德國DrEhrenstorfer GmbH）、赤蘚紅（86.0%，德國DrEhrenstorfer GmbH）

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 000 mg/L）配制

使用ME205DU 電子天平，準(zhǔn)確稱取各色素標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL 容量瓶中，用少量水溶解，然后加水至刻度，混勻，得到各個(gè)色素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度均為1 000 mg/L，將配制好的儲備液在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

分別移取1 mL 各色素儲備液于25 mL 棕色安瓿瓶中，混勻后，各色素濃度為100 mg/L。臨用時(shí)根據(jù)需要，準(zhǔn)確移取相應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，用水稀釋配制成0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、70 mg/L、100 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品前處理過程

1.4.1 樣品中色素的提取

糕點(diǎn)、熟肉等固體樣品：稱取1.0 g 已粉碎均勻的樣品于50 mL 離心管中，加入30 mL 色素提取液A，手動震搖2 min 使之與樣品充分混合，然后放入預(yù)先升溫至50 ℃的超聲波清洗機(jī)中，超聲處理30 min（在此期間每隔10 min 手動震搖離心管數(shù)次），然后6 000 rpm/min 下離心4 min。將離心得到的上清液轉(zhuǎn)入50 mL 雞心瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸至上清液約15 mL，再加入3 mL 甲酸混勻，待凈化。

1.4.2 凈化

依次用5 mL 甲醇、5 mL 10%甲酸水溶液活化ProElut PWA-2 固相萃取小柱；加入待凈化液，棄去流出液；加入5 mL 甲醇，棄去流出液；加入5 mL 15%氨水甲醇溶液，收集流出液；將收集到的流出液于50 ℃下N2吹至盡干，然后用水定容至1 mL，供上機(jī)檢測。整個(gè)需要過程控制液體流下速度為1 滴/s。

1.4.3 儀器條件

色譜柱：Inspire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（B）+0.02 mol/L 乙酸銨（A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：254 nm，梯度洗脫程序見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的選擇

目前，針對人工合成色素的檢測方法已經(jīng)有較多報(bào)道［19-24］，而大部分方法采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，因所需儀器設(shè)備檢測成本較高，并不適合日常檢測工作。本研究采用高效液相色譜儀檢測食品中10 種人工合成色素，為人工合成色素的日常檢測提供了便捷。

表1 梯度洗脫程序

2.2 流動相選擇

GB 5009.35-2016 中采用的流動相為0.02 mol/L 的乙酸銨和甲醇作為流動相，為了實(shí)現(xiàn)10 種人工合成色素的有效分離，參考相關(guān)文獻(xiàn)［19］，本研究決定采用乙腈和0.02 mol/L 的乙酸銨作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。仍然采用254 nm 波長進(jìn)行檢測，10 種人工合成色素的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（濃度為10 mg/L）如圖1所示，各種色素的保留時(shí)間和分離度如表2 所示。由圖可知，10 種人工合成色素的分離度均大于1.5，說明該方法所選用的流動相和梯度洗脫程序能夠?qū)崿F(xiàn)食品中10 種人工合成色素的有效分離。

圖1 10 種人工合成色素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

表2 10 種人工合成色素的分離度

2.3 提取方法的選擇

GB 5009.35-2016 中采用的提取液為水，需將樣品用水反復(fù)洗脫至無色，而由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，有些樣品中的色素并不能完全被水洗掉，于是夏宗艷等人［25］比較了水、乙醇- 氨水混合溶液（90:10，V/V）和丙酮- 水混合溶液（90:10，V/V）等3 種不同提取液對色素的提取效果，最后采用丙酮- 水（90:10，V/V）作為色素提取液，但是該提取液中使用了丙酮，丙酮為易制毒，且較容易揮發(fā)。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)［26］，采用一定比例的乙醇乙腈再與水和氨水混合制備得到的混合液作為色素提取液，經(jīng)添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該提取液具有良好的提取效果。

2.4 線性范圍和檢出限

分別配制濃度為0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、70 mg/L、100 mg/L 的10 種色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法的色譜條件，對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列混合溶液進(jìn)行分析，以不同色素的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)（mg/L），以峰面積Y 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得到10 種色素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和相關(guān)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各種色素均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以3 倍信噪比確定檢出限。方法的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)及檢出限見表3。

表3 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

由表3 可以看出，該方法的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 99，檢出限在0.05～0.17 mg/kg 之間，說明該方法具有很好的線性范圍和較低的檢出限，能夠?qū)崿F(xiàn)食品中多種人工合成色素的靈敏檢測。

2.5 方法可行性

為了驗(yàn)證方法的可行性，本研究選用基質(zhì)比較復(fù)雜的粉絲、熟肉、水餃三種樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，添加水平為10 mg/kg，回收率結(jié)果詳見表4。

表4 不同基質(zhì)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果%

從表中可以看出，在3 種不同樣品基質(zhì)中，各種色素的添加回收率在72.8%～105.8%，說明該方法具有較好的回收率，能滿足食品中人工合成色素的分析檢測，說明本研究所確定的方法具有一定的可行性。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法建立了一種同時(shí)檢測食品中10 種人工合成色素的方法，并采用ProElut PWA-2 固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化，具有操作簡單快速、測定結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。所采用的色譜分離條件能有效地將10 種人工合成色素進(jìn)行分離，并能在18 min 內(nèi)完成對樣品的分析檢測。該方法具有樣品處理簡單、靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、分析時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)，可為我國食品檢測行業(yè)提供參考和技術(shù)支持。