消腫止痛合劑對(duì)大鼠缺血皮瓣血管再生及VEGF-Dll4/Notch信號(hào)通路的影響

姚興璋, 劉濤, 何志軍*, 李興勇, 宋淵, 李巖, 李金鵬, 陳文, 王海剛, 何元旭

(1.甘肅省中醫(yī)院 骨科, 甘肅 蘭州 730050; 2.甘肅省人民醫(yī)院 骨科, 甘肅 蘭州 730000;3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)臨床學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020)

隨機(jī)型皮瓣常被用來(lái)覆蓋整形和創(chuàng)傷手術(shù)中的淺表皮膚缺損，盡快促進(jìn)血管新生是皮瓣成活的關(guān)鍵.中醫(yī)藥在這方面取得了一定的研究進(jìn)展[1].前期臨床研究發(fā)現(xiàn)消腫止痛合劑可顯著降低軟組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6), 促進(jìn)皮瓣成活，降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)炎性因子水平，阻止外傷后炎癥介質(zhì)的釋放[2].血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的首要因子，在血管生成過(guò)程中非常關(guān)鍵[2-3].通常VEGF指的是VEGF-A，其結(jié)合受體包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(VEGFR1)和受體2(VEGFR2).目前針對(duì)中醫(yī)藥通過(guò)VEGF-Dll4/Notch信號(hào)通路調(diào)控皮瓣還少見報(bào)道.本研究采用大鼠隨意皮瓣模型，利用消腫止痛合劑以及VEGF-Dll4/Notch信號(hào)通路阻斷劑干預(yù)，觀察皮瓣成活率，將進(jìn)一步揭示VEGF-Dll4/Notch信號(hào)通路在皮瓣血管再生中的作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4月齡240只SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200～240) g，購(gòu)自甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SYXK(甘)2016-0012.飼養(yǎng)條件: 環(huán)境溫度為23 ℃～25 ℃，濕度為60%～70%，給予正常飲水和進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后開始實(shí)驗(yàn).動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn). VEGF、Notch1、Dll4抗體(購(gòu)自Abcam公司), VEGFR抑制劑Axitinib、Notch-1抑制劑MK-0752(購(gòu)自Selleck公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔(購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Western blot檢測(cè)試劑盒(索萊寶科技有限公司)，免疫組織化學(xué)染色二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒(博士德生物工程有限公司)，蛋白濃度測(cè)定試劑盒(索萊寶科技有限公司)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組

將240只大鼠隨機(jī)分為6組，正常組、假手術(shù)組、模型組、消腫止痛合劑組(消腫組)、Axitinib+消腫止痛合劑組(AXI+消腫組)、MK-0752+消腫止痛合劑組(MK+消腫組).每組又分4種不同時(shí)間，5 d組、10 d組、15 d組、20 d組，每組10只.

1.2.2 模型建立

除正常組外所有 SD 大鼠禁食 6～8 h.術(shù)前行水合三氯乙醛腹腔麻醉，在背部勾勒2 cm×8 cm尾端區(qū)域，假手術(shù)組按設(shè)計(jì)線切開皮膚至深筋膜層，不掀起皮瓣。模型組和消腫組將皮膚與筋膜分離，隨意皮瓣用4-0絲縫合回原位[3].待麻醉完全恢復(fù)后送回飼養(yǎng)籠，進(jìn)行觀察.術(shù)后每日早上肌注青霉素 12 萬(wàn) U，連用3 d.

1.2.3 藥物處理

消腫止痛合劑，由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心生產(chǎn)，注冊(cè)文號(hào)：甘衛(wèi)普制準(zhǔn)字(1997)-202-04，批號(hào)：20051122，規(guī)格：250 mL/瓶.消腫組每日灌胃服用1 mL/100g (每毫升含生藥 0.09g)消腫止痛合劑, AXI+消腫組每日灌胃服用1 mL/100 g消腫止痛合劑和0.03 mg/g的VEGFR抑制劑Axitinib，MK+消腫組每日灌胃服用1 mL/100 g消腫止痛合劑和0.03 mg/g的Notch-1抑制劑MK-0752,模型組、空白組和假手術(shù)組每日灌服相應(yīng)體積的蒸餾水.服藥5，10，15和20 d后分批麻醉并處死大鼠，剝離皮瓣組織多聚甲醛固定或-80 ℃保存.

1.2.4 皮瓣成活率

通過(guò)透明硫酸紙描繪各組皮瓣形態(tài),壞死區(qū)域采用墨汁涂黑.皮瓣存活面積與總面積之比即皮瓣成活率.

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色

洗滌后，用體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活，組織抗原用濃度為10.2 mol/L檸檬酸鈉緩沖液修復(fù).用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白阻斷30 min.VEGFA抗體，Dll4抗體，Notch-1抗體，在4 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜.用HRP結(jié)合二級(jí)抗體(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000)孵育，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復(fù)染,脫水封片，顯微觀察，采集照片.

1.2.6 Western blot 法檢驗(yàn)蛋白表達(dá)

勻漿，用BCA法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)定量蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度.含有等量蛋白質(zhì)(60 μg)的樣品在質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%凝膠中分離，并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉后，用以下主要抗體在4 ℃過(guò)夜進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)：VEGF抗體(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000)，Dll4抗體(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000)，Notch-1抗體(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000)和β-actin抗體(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶2 000).洗滌后，用HRP結(jié)合二級(jí)抗體(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶5 000)處理2 h，用ECL-Plus試劑盒進(jìn)行觀察.imagelab 3.0軟件測(cè)量譜帶強(qiáng)度.

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，各組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊者兩組間的差異比較用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者兩組間的差異比較用Dunnett’s 檢驗(yàn)法，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 皮瓣成活率檢測(cè)結(jié)果

第5、10、15、20天消腫組皮瓣成活情況顯著高于模型組(P<0.05)，加入VEGF阻斷劑后，消腫+AXI組皮瓣成活率下降(P<0.05)，當(dāng)加入Notch阻斷劑后，消腫+AXI組皮瓣成活率上升(P<0.05)(圖1-2).

圖1 20 d皮瓣透明硫酸紙準(zhǔn)確描繪結(jié)果Fig.1 The results of 20 d skin flap with transparent sulfuric acid paper

2.2 VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

第5、10、15、20天與假手術(shù)組相比，模型組皮瓣內(nèi)的VEGF相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.01).當(dāng)加入消腫止痛合劑后，VFGF相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增加，且顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).當(dāng)加入VEGF阻斷劑后，消腫止痛合劑引起的VEGF相對(duì)表達(dá)量增加的趨勢(shì)被有效抑制，消腫+AXI組的VEGF相對(duì)表達(dá)量顯著低于消腫組(P<0.05).當(dāng)加入Notch阻斷劑后，消腫止痛合劑引起VEGF增加的趨勢(shì)更加明顯(P<0.05)，以第15天增加最明顯(圖3-7).

1)與假手術(shù)組比較,P<0.05;2)與模型組比較，P<0.05;3)與消腫組比較，P<0.051)Compared with sham operation group, P<0.05; 2)Compared with model group, P<0.05; 3) Compared with detumescence group, P<0.05圖2 皮瓣成活率結(jié)果Fig.2 Results of flap survival rate

圖3 藥物處理5 d后VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical staining results of VEGF after 5 days of drug treatment

圖4 藥物處理10 d后VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.4 Immunohistochemical staining results of VEGF after 10 days of drug treatment

圖5 藥物處理15 d后VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.5 Immunohistochemical staining results of VEGF after 15 days of drug treatment

圖6 藥物處理20 d后VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.6 Immunohistochemical staining results of VEGF after 20 days of drug treatment

1)與假手術(shù)組比較,P<0.05;2)與模型組比較，P<0.05;3)與消腫組比較，P<0.051) Compared with sham operation group, P<0.05; 2)Compared with model group, P<0.05; 3) Compared with detumescence group, P<0.05圖7 不同時(shí)間點(diǎn)VEGF平均光密度值比較Fig.7 Comparison of VEGF mean optical density at different time points

2.3 VEGFA、Notch和Dll4 蛋白表達(dá)檢測(cè)

與假手術(shù)組相比，模型組VEGFA、Notch、Dll4蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，當(dāng)利用消腫止痛合劑處理后，VEGFA、Notch、Dll4 蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步增加，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).然而，當(dāng)加入VEGF抑制劑后，消腫止痛合劑引起的VEGFA、Notch、Dll4 蛋白表達(dá)增加的趨勢(shì)被顯著抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).當(dāng)加入Notch抑制劑后，消腫止痛合劑引起VEGFA 表達(dá)增加，Notch、Dll4表達(dá)減少(P<0.05,圖8).

1)與假手術(shù)組比較,P<0.05;2)與模型組比較，P<0.05;3)與消腫組比較，P<0.051) Compared with sham operation group, P<0.05; 2)Compared with model group, P<0.05; 3) Compared with detumescence group, P<0.05圖8 藥物處理后10 d皮瓣組織中VEGFA、Notch、和Dll4 蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.8 Expression of VEGFA, notch and Dll4 protein in skin flap tissue after 10 days of drug treatment

3 討論

術(shù)后遠(yuǎn)端組織缺血壞死是隨機(jī)皮膚預(yù)后不良的重要原因.隨機(jī)皮瓣在無(wú)特定血管的情況下，主要依靠新的毛細(xì)血管網(wǎng)灌注[4].由于沒(méi)有特定血管的限制，導(dǎo)致皮瓣具有彈性，但也容易引起組織缺血壞死.術(shù)后血管生成從隨意皮瓣的蒂部開始，向遠(yuǎn)端部位血管新生減少.因此組織缺血壞死多發(fā)生在遠(yuǎn)端，限制了隨意皮瓣的長(zhǎng)寬比(1.5～2.0∶1)，促進(jìn)血管生成能夠增加隨機(jī)皮瓣的存活率[5].然而，一旦血管生成及隨后的血液灌流，就會(huì)導(dǎo)致缺血再灌注損傷.缺血組織發(fā)生氧化應(yīng)激，損傷隨意皮瓣，并伴有細(xì)胞凋亡.因此，尋求更好的藥物和方法，改善皮瓣血運(yùn)狀況[6]、盡快促進(jìn)皮瓣血管再生是提高皮瓣成活率的重點(diǎn).

消腫止痛合劑由川芎、三七、赤芍、生地、當(dāng)歸、青皮、桃仁、紅花、木香、澤蘭等組成,具有活血通絡(luò)、消腫止痛之療效.臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，消腫止痛合劑能夠減輕創(chuàng)傷后肢體腫脹消退及疼痛、促進(jìn)瘀血吸收，降低炎癥指標(biāo)[1,7-8].川芎嗪對(duì)腦缺血/再灌注損傷等缺血性疾病患者有良好的治療作用，具有抗氧化應(yīng)激特性以及促進(jìn)新生血管形成和減少細(xì)胞凋亡的能力，能促進(jìn)穿支皮瓣的成活[9].紅花苷增加了超氧化物歧化酶活性，降低了丙二醛水平，促進(jìn)自由基清除，保護(hù)組織避免缺血再灌注的損傷[11].赤芍、桃仁和當(dāng)歸提取已被報(bào)道具有抗血栓的活性，能通過(guò)增加組織供氧、誘導(dǎo)抗炎作用和調(diào)節(jié)線粒體功能障礙來(lái)調(diào)節(jié)糖酵解、無(wú)氧和有氧代謝紊亂[11-12].

VEGF和Notch信號(hào)通路都是血管生成過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子.在生理和病理血管生成過(guò)程中，VEGF和Notch信號(hào)通路緊密協(xié)調(diào)構(gòu)成芽的內(nèi)皮細(xì)胞之間平衡尖端和莖細(xì)胞表型[13-14].VEGF-Dll4/Notch信號(hào)通路對(duì)血管再生調(diào)節(jié)的具體機(jī)制為：VEGFA通過(guò)與VEGFR2結(jié)合刺激并誘導(dǎo)內(nèi)皮頂端細(xì)胞表達(dá)Dll4，Dll4與鄰近柄細(xì)胞內(nèi)的Notch信號(hào)結(jié)合，通過(guò)下調(diào)VEGFR2和上調(diào)VEGFR1的表達(dá)水平，抑制頂端細(xì)胞表型促進(jìn)柄細(xì)胞特化，使二者之間保持在一個(gè)合適的比例以確保血管出芽的精確性.可見，VEGF是Dll4的正向調(diào)節(jié)因素，而Dll4是VEGF信號(hào)的負(fù)向調(diào)節(jié)因素.VEGF-Dll4/Notch信號(hào)通路在腫瘤血管再生及抗腫瘤藥物治療方面研究較多，但是在皮瓣血管再生方面卻未見報(bào)道[15].

本研究著重研究消腫止痛合劑對(duì)VEGF-Dll4/Notch信號(hào)激活與血管新生的作用.皮瓣由于缺血缺氧的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，造成不可逆的損傷，所以臨床治療中需要促進(jìn)血管的新生，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞完整.本實(shí)驗(yàn)中造模后第5天模型組VEGF蛋白平均光密度值表達(dá)升高，第10天模型組仍呈高表達(dá)，第15天達(dá)到峰值，隨后下降.分別對(duì)比消腫組與模型組、消腫+AXI組、消腫+MK組，VEGF表達(dá)在組別及時(shí)間主效應(yīng)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.說(shuō)明消腫止痛合劑可顯著提高皮瓣成活率，免疫組織化學(xué)染色顯示增加了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，由于VEGF是促進(jìn)血管形成的起始關(guān)鍵細(xì)胞因子，激活Notch和Dll4信號(hào)，這樣的作用無(wú)疑是血管形成的關(guān)鍵.VEGF阻斷劑可引起VEGFA、Notch和Dll4蛋白表達(dá)增加的抑制，Notch信號(hào)阻斷劑引起對(duì)Notch、Dll4 蛋白的抑制，VEGFA 蛋白表達(dá)繼續(xù)增加.抑制Dll4/Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過(guò)促進(jìn)新生血管和血管生成，提高皮瓣成活率.

本研究提示，VEGF-Dll4/Notch信號(hào)通路在皮瓣再生中發(fā)揮著重要的作用，Notch阻斷劑的應(yīng)用促進(jìn)了血管再生，這可能是Notch阻斷劑增加了VEGF的水平，VEGF在早期對(duì)皮瓣再生意義重大.