VEGF-D、P-gp及P15蛋白在腦膠質瘤患者中的表達及與臨床病理特征和預后的相關性

向 斌，杜 軍，張維波，劉 盛

腦膠質瘤是由神經外胚葉衍化而來的膠質細胞發(fā)生的腫瘤，為顱內腫瘤中常見的一種，發(fā)病率為36%～63%[1-2]。腦膠質瘤惡化程度高，侵襲力強，臨床一般藥物治療無法透過血腦屏障，即使使用放療臨床效果也不明顯，手術治療難以完全清除，術后復發(fā)率高[3]。因此，探索新的治療及早期診斷方法為目前研究熱點。既往認為腦膠質瘤的發(fā)生與后期發(fā)展有多種因素、步驟、基因變異參與。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，發(fā)現惡性腫瘤細胞周期控制紊亂是導致其增生失控從而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[4-5]。因此，本文分析血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、P-糖蛋白(P-gp)及P15蛋白在腦膠質瘤患者中的表達及與臨床病理特征和預后的相關性，旨在為腦膠質瘤的臨床診斷、治療及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年1月—2019年2月我院收治的經手術后病理檢查確診為腦膠質瘤患者69例的臨床資料。納入標準：臨床資料、病理資料完整；簽署相關知情同意書；不存在其他影響本研究的疾病；卡氏評分在70分以上；預計生存時間1年以上。排除標準：治療前存在遠處轉移者；臨床資料不完整者；病理檢查前應用放療、化療等治療者；存在免疫或血液系統疾病者。69例中男37例，女32例；年齡30～75(46.35±6.88)歲；膠質瘤Kernohan分級：Ⅰ～Ⅱ級28例、Ⅲ～Ⅳ級41例；腫瘤直徑≥5 cm 38例，<5 cm 31例；分化程度：低分化25例，中高分化44例。

1.2方法

1.2.1VEGF-D、P-gp及P15蛋白檢測方法：VEGF-D、P-gp及P15蛋白檢測均使用免疫組織化學染色。單克隆即用型抗體和免疫組織化學超敏SP試劑盒(SP Kits)均購自福州邁新生物技術公司，所有標本均使用10%福爾馬林液固定，常規(guī)HE染色切片，并為了防止脫玻片按試劑盒說明書操作，設置已知VEGF-D、P-gp及P15蛋白組織切片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液作為陰性對照。VEGF-D細胞質呈黃棕色或褐色為陽性表達，P-gp細胞膜或細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達，P15蛋白細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性表達。按照陽性細胞多少判斷其陽性程度，隨機觀察5個高倍鏡視野，計算1000個瘤細胞中染色陽性細胞所占比例。無明顯顯色陽性細胞為陰性，陽性細胞數>10%為陽性。另選取手術治療時切除的正常組織(距腫瘤灶邊緣3 cm，病理檢查證實無非典型增生及腫瘤細胞)作為對照。

1.2.2隨訪：所有患者給予手術后輔助放化療，在結束后每隔3個月進行復查，根據其影像學檢查結果、臨床表現、實驗室檢查結果等作為復查診斷指標。從治療結束后1周起隨訪1年。

1.3觀察指標 比較69例癌組織、正常組織及不同臨床病理特征患者VEGF-D、P-gp及P15蛋白表達情況，分析VEGF-D、P-gp及P15蛋白與腦膠質瘤臨床病理特征和預后的相關性。

2 結果

2.1不同組織中VEGF-D、P-gp及P15蛋白陽性表達情況 瘤組織中VEGF-D、P-gp陽性表達率明顯高于正常組織，P15蛋白陽性表達率低于正常組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 69例腦膠質瘤患者不同組織中VEGF-D、P-gp及P15蛋白陽性表達情況[例(%)]

2.2臨床病理特征與VEGF-D、P-gp及P15蛋白表達的關系 VEGF-D、P-gp及P15蛋白表達與腫瘤病理分級、分化程度有明顯相關性(P<0.05或P<0.01)，與性別、年齡、腫瘤直徑無明顯相關性(P>0.05)。見表2。

表2 69例腦膠質瘤患者臨床病理特征與VEGF-D、P-gp及P15蛋白表達的關系(例)

2.3影響腦膠質瘤患者預后單因素分析 治療后對患者隨訪1年，根據預后情況分為預后良好50例(72.46%)，預后不良19例(27.54%)。年齡、腫瘤病理分級、腫瘤分化程度及VEGF-D、P-gp、P15蛋白表達情況為影響腦膠質瘤患者預后的相關因素(P<0.05或P<0.01)；性別、腫瘤直徑與患者預后不相關(P>0.05)。見表3。

表3 影響腦膠質瘤患者預后的單因素分析(例)

2.4影響腦膠質瘤患者預后多因素分析 經多因素分析可知，年齡>45歲、病理分級Ⅲ～Ⅳ級、VEGF-D陽性表達、P-gp陽性表達、P15蛋白陰性表達及分化程度低為影響腦膠質瘤患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 影響腦膠質瘤患者預后的多因素分析

3 討論

有研究表明，腫瘤的發(fā)展、浸潤、復發(fā)、轉移等和腫瘤的血管生成有著密切的關系，腫瘤血管生成與各種調節(jié)因子密不可分[6-7]。血管內皮生長因子(VEGF)作為淋巴細胞生長因子同時也屬于主要的調節(jié)因子[8]，腫瘤的血管生成是由其家族成員和受體之間的相互作用所致[9]。VEGF-D則是其家族中的一員，既往文獻研究發(fā)現采用fms樣酪氨酸激酶4(Flt-4)親和層析法將VEGF從人前列腺癌細胞中分化后，可激活淋巴管內皮上的受體，提示其屬于一種特異性較高的血管內皮細胞有絲分裂元，對淋巴管、血管生成有刺激作用，在與受體VEGFR-2、3結合后可出現信號傳導[10]。除此之外大量研究還發(fā)現，VEGF-D在肺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中均有較高表達[11-12]。VEGF作為重要的促腫瘤血管生成因子，也是影響患者預后的獨立危險因素。Flt-4在早期的胚胎血管中發(fā)育，在發(fā)育后期僅出現在發(fā)育中的淋巴管內皮細胞中。VEGF-D則是淋巴生成的重要信號傳導通路。本研究發(fā)現，VEGF-D在腦膠質瘤瘤組織中表達明顯高于正常組織，在不同病理分級、不同分化程度患者中表達有差異，結合既往文獻提示其在腦膠質瘤病變、發(fā)展中存在重要的作用[13]。

P15蛋白定位于人染色體9p21區(qū)上，在神經膠質瘤中，該區(qū)基因有著較高的丟失率。已經有研究發(fā)現，在腦膠質瘤中存在P15基因缺失情況[14]。孫飛等[15]對腦膠質瘤標本進行檢測發(fā)現，患者P15基因存在明顯缺陷。P15、P16基因缺失則在惡性程度高的腦膠質瘤中多見。P15基因可與CDK4/CDK6結合，抑制該酶活性，阻止細胞進展至G1期，在其缺少后抑制作用降低，癌基因中cyclinD就會占據優(yōu)勢與CDK4/CDK6結合，過度刺激細胞分裂增殖最終導致癌變。本研究正常組織中P15蛋白表達明顯高于癌組織，與既往文獻結果相符[16-17]。

在臨床腫瘤治療中，腫瘤細胞對于化學藥物的敏感性是影響手術治療效果的主要因素，術后復發(fā)概率高和腫瘤對化療藥物耐受性增加有關[18]。既往認為腫瘤治療中的獲得性多藥耐藥是由抗癌藥物誘導產生。有研究通過比較化療前后患者P-gp的表達情況，了解到化療組P-gp陽性表達增加，且認為其是獲得性或原發(fā)性的[19]。徐凡等[20]對未經化療的原發(fā)性腦膠質瘤患者進行體外細胞培養(yǎng)，在其惡變過程中發(fā)現P53、ras、MDR1等癌基因被激活現象，且MDR1 mRNA的異?；罨瘜е翽-gp的表達增加，出現此類原發(fā)性耐藥機制是導致患者首次化療失敗的重要原因之一。本研究發(fā)現，在正常組織中P-gp并不表達，與既往文獻研究結果相符[21]。進一步研究發(fā)現，VEGF-D、P-gp及P15蛋白在腦膠質瘤中的表達與其腫瘤病理分級、分化程度有明顯相關性，且VEGF-D陽性表達、P-gp陽性表達、P15蛋白陰性表達為影響腦膠質瘤患者預后不良的獨立危險因素。結合既往文獻分析，VEGF-D、P-gp及P15蛋白在腦膠質瘤的發(fā)展中存在著重要的作用，說明VEGF-D陽性表達、P-gp陽性表達、P15蛋白陰性表達者病情較嚴重，且術后復發(fā)率較高，預后差[22]。

綜上所述，VEGF-D、P-gp在腦膠質瘤患者中表達增加，P15蛋白表達降低，三者表達情況變化可為患者治療方案制定、預后評估提供重要的參考。