基于半定量分析方法的藥對配伍對制首烏成分含量及DPPH自由基清除能力影響研究

張慧杰，任曉亮，孫 浩，王雅琦，王 磊，梁 穎*，張 宇*，劉 燕

基于半定量分析方法的藥對配伍對制首烏成分含量及DPPH自由基清除能力影響研究

張慧杰1，任曉亮2，孫 浩1，王雅琦1，王 磊1，梁 穎1*，張 宇1*，劉 燕1

1. 天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

采用半定量分析方法對制首烏與9個補(bǔ)虛藥配伍后成分含量及DPPH自由基清除能力變化進(jìn)行研究。以UPLC-DAD建立制首烏多成分半定量分析方法，對制首烏與9味常用補(bǔ)虛藥（當(dāng)歸、熟地黃、白芍、黨參、黃芪、甘草、麥冬、枸杞子、墨旱蓮）配伍后成分含量變化進(jìn)行分析。采用DPPH法分別測定單味藥以及配伍藥對的自由基清除能力，繪制量-效曲線并計算半數(shù)清除濃度（EC50）。采用多元統(tǒng)計分析方法建立制首烏中多成分含量與DPPH自由基清除能力間的量-效回歸模型，篩選量-效關(guān)系中影響顯著的化學(xué)標(biāo)志物，并通過質(zhì)譜進(jìn)行定性分析。線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性5項方法學(xué)驗證結(jié)果表明，半定量分析方法可用于制首烏中12個成分在配伍前后的含量對比分析。含量對比分析結(jié)果表明，制首烏與不同藥物配伍后，12個成分的含量均發(fā)生了不同程度的變化，且與墨旱蓮配伍后制首烏中有33%的成分含量顯著降低（＜0.05）、42%的成分含量顯著升高外（＜0.05），與另8味藥配伍后制首烏中至少50%的成分含量顯著降低（＜0.05）。DPPH自由基清除能力實(shí)驗結(jié)果顯示，制首烏DPPH自由基清除能力高于其他9味中藥，配伍后9個制首烏藥對的DPPH自由基清除能力低于制首烏，但高于相應(yīng)的配伍藥物。量-效回歸正交偏最小二乘法（orthogonal projections to latent structures，OPLS）模型中2X、2Y及2值分別為0.841、0.981及0.962，篩選出4個量-效關(guān)系化學(xué)標(biāo)志物，分別為反式-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2--β--吡喃葡萄糖苷（-THSG）、大黃素甲醚、順式-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2--β--吡喃葡萄糖苷（-THSG）、大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷（EG）。建立的多成分半定量分析方法可用于何首烏在藥對配伍過程中多成分含量變化的對比分析，-THSG、大黃素甲醚、-THSG、EG是影響制首烏在上述藥對中發(fā)揮DPPH自由基清除作用的化學(xué)標(biāo)志物，可為制首烏藥對配伍機(jī)制的深入研究提供參考。

制首烏；藥對；補(bǔ)虛藥；半定量分析；DPPH法；自由基清除作用；當(dāng)歸；熟地黃；白芍；黨參；黃芪；甘草；麥冬；枸杞子；墨旱蓮；多元統(tǒng)計分析；化學(xué)標(biāo)志物；反式-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2--β--吡喃葡萄糖苷；大黃素甲醚；順式-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2--β--吡喃葡萄糖苷；大黃素-8--β--吡喃葡萄糖苷

何首烏為蓼科何首烏屬植物何首烏Thunb.的干燥塊根，始載于北宋《開寶本草》[1]，生品具有解毒消癰、潤腸通便的功效，制品（制首烏）是其經(jīng)清蒸、黑豆汁蒸或煮后的炮制品，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏髭發(fā)等功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，其具有較強(qiáng)的抗氧化活性以及益智、延緩衰老、調(diào)血脂等藥理作用[3-5]。目前對何首烏配伍的研究報道較少，有學(xué)者通過對不同配比的制首烏-牛膝配伍過程多成分含量變化及指紋圖譜進(jìn)行分析，表明制首烏與牛膝配伍的最佳比例為2∶1和1∶1[6]，且與牛膝以1∶1比例配伍后對維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松治療作用顯著[7]；與決明子、荷葉、山楂配伍后，制首烏中主要成分二苯乙烯苷含量均顯著降低[8]。此外，除1篇臨床研究報道[9]中指出萊菔子與何首烏配伍引起口干、頭暈、神志恍惚等不良反應(yīng)外，尚未檢索到其他關(guān)于何首烏的配伍不良反應(yīng)研究報道。

制首烏常與熟地黃、當(dāng)歸、丹參、赤芍等補(bǔ)虛藥、活血藥配伍使用[10-12]，課題組前期建立了32個制首烏配伍藥對指紋圖譜，指認(rèn)出歸屬于制首烏的12個共有峰并對峰面積變化進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示制首烏與補(bǔ)虛類藥物配伍過程中其成分含量變化具有相似性。本實(shí)驗在前期工作基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜串聯(lián)二極管陣列檢測器（UPLC- DAD）建立制首烏多成分半定量分析方法[13]，并對制首烏與9味補(bǔ)虛藥（當(dāng)歸、熟地黃、白芍、黨參、黃芪、甘草、麥冬、枸杞子、墨旱蓮）配伍后成分含量進(jìn)行對比分析，以1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除法測定各單味藥及藥對的自由基清除能力[14-15]，通過量-效回歸模型篩選出標(biāo)志物，以期為制首烏補(bǔ)虛藥對配伍機(jī)制的深入研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品及試劑

制首烏，產(chǎn)地四川，批號150802，購于四川新荷花中藥飲片有限公司，經(jīng)天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院孫浩副主任中藥師鑒定為蓼科何首烏屬植物何首烏Thunb.的干燥塊根的炮制品，當(dāng)歸（產(chǎn)地甘肅）、熟地黃（產(chǎn)地河南）、白芍（產(chǎn)地安徽）、黨參（產(chǎn)地甘肅）、黃芪（產(chǎn)地內(nèi)蒙古）、甘草（產(chǎn)地內(nèi)蒙古）、麥冬（產(chǎn)地四川）、枸杞子（產(chǎn)地寧夏）、墨旱蓮（產(chǎn)地河北），購于毫州市京皖中藥飲片廠，并經(jīng)天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院孫浩副主任中藥師鑒定，分別為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根、玄參科地黃屬植物地黃Libosch的干燥塊根的炮制品、毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根、桔?？浦参稂h參(Franch.)的干燥根、豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Fisch) Bge. var.(Bge.) Hsiao、豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根及根莖、百合科沿階草屬植物麥冬(L. f.) Ker-Gawl.的干燥塊根、茄科枸杞屬植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實(shí)、菊科鱧腸屬植物鱧腸L.的干燥地上部分。

反式-2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-β--吡喃葡萄糖苷（-THSG）對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號110844-200606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；大黃素-8-β--吡喃葡萄糖苷（EG）對照品，四川維克奇生物科技有限公司，批號150925，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。

甲醇，色譜純，美國Sigma公司；甲酸，色譜純，美國Meridian Medical Technologies公司；蒸餾水，北京屈臣氏蒸餾水有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH），分析純，美國Sigma公司，批號BJ1200455213A。

1.2 儀器

Acquity UPLCTMsystem超高效相色譜儀、Xevo G2-XSQ-TOF質(zhì)譜儀，美國Waters公司；TU-1901紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；1000 mL KDM調(diào)溫電熱套，山東省鄄城永興儀器廠；TG16-WS臺式高速離心機(jī)，湖南省湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)，日本東京理化器械株式會社；BT125D十萬分之一天平，德國Sartorius公司；JA31002電子天平，上海精天電子儀器有限公司；KH3200B超聲波清洗器，江蘇省昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 飲片吸水量測定

中藥煎煮過程中其吸水量是影響得液量、成分溶出的重要因素[16]，為保證成分溶出體積環(huán)境的一致性，本研究首先對各單味飲片的吸水量進(jìn)行考察，隨后根據(jù)單味飲片吸水結(jié)果計算藥對配伍提取的加水量，通過測定實(shí)際得液量與期望得液量間的相對誤差來確定藥對配伍提取的加水量。

2.1.1 單味飲片吸水系數(shù)的測定 分別稱取包括制首烏在內(nèi)的上述10味飲片各10.0 g，以20倍料液比加入溶劑，即200 mL的水，浸泡1 h后回流提取，以回流下第1滴水開始計時，隨后保持提取液的微沸狀態(tài)，提取時間為1 h，提取液以3層紗布趁熱濾過，濾液冷卻后量取體積，根據(jù)公式計算吸水系數(shù)，各飲片的吸水系數(shù)測定結(jié)果如表1所示。

吸水系數(shù)＝(實(shí)際加液量－實(shí)際得液量)/飲片質(zhì)量

2.1.2 藥對配伍時飲片加水量的驗證 依據(jù)單味飲片吸水情況的考察結(jié)果，分別稱取藥對中2味飲片各10.0 g，以制首烏質(zhì)量計以20倍料液比加入溶劑，即200 mL水，根據(jù)表1結(jié)果在上述體積外再加入對應(yīng)質(zhì)量的飲片的吸水體積（取整數(shù)），按“2.1.1”項下方法操作提取后，測定藥對配伍時提取液的體積，并根據(jù)公式計算加水量相對誤差，其中期望得液量為200 mL，計算結(jié)果如表2所示。

結(jié)果顯示，實(shí)測藥對得液量均高于期望得液量，相對誤差在2.5%～6.5%，低于10%，本研究認(rèn)為單味飲片提取與藥對配伍時提取過程中的溶劑體積環(huán)境基本一致，即忽略溶劑體積對成分溶出造成的影響。

相對誤差＝(實(shí)際得液量－期望得液量)/期望得液量

2.2 樣品制備

2.2.1 單味飲片樣品制備 取單味飲片100 g，稱定，以料液比為1∶20加入水，并加入根據(jù)表1中相應(yīng)飲片吸水系數(shù)計算的吸水體積，浸泡1 h后，回流提取1 h，3層紗布濾過，濾液備用。平行3次。

2.2.2 藥對配伍樣品制備 分別取各配伍中藥飲片100 g與制首烏100 g，稱定，根據(jù)表2所示實(shí)際加液量的10倍量加水，浸泡1 h后，回流提取1 h，后續(xù)操作同單味藥樣品制備方法。

2.2.3 提取物凍干粉的制備 分別將上述單味藥、藥對配伍提取液于60 ℃減壓濃縮并冷凍干燥后制得單味藥及藥對配伍的凍干提取物，以供后期分析測定用。

表1 單味飲片吸水系數(shù)測定結(jié)果

表2 藥對配伍時飲片吸水情況考察結(jié)果

2.3 半定量分析方法的建立

2.3.1 基本理論 單味藥標(biāo)定的半定量分析法是以連續(xù)稀釋的單味藥提取液的生藥質(zhì)量濃度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物的峰面積響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而對樣品中相應(yīng)化合物進(jìn)行定量分析，計算公式如下[14]。

m＝(－)/（1）

m為單味藥的生藥質(zhì)量濃度，本實(shí)驗中指制首烏的生藥質(zhì)量濃度，為目標(biāo)化合物的色譜峰面積，、分別為以單味藥質(zhì)量濃度所標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與截距

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取提取物凍干粉50.0 mg，加入5 mL蒸餾水，超聲30 min復(fù)溶后，取1 mL溶液置于5 mL量瓶，并以50%甲醇定容，渦旋混勻后以3500 r/min離心20 min，上清液0.22 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液進(jìn)樣分析。

2.3.3 色譜條件 Acquity UPLC BEH shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，進(jìn)樣量5 μL；體積流量0.4 mL/min；柱溫45 ℃；檢測波長254 nm。采用梯度洗脫程序1（0～2 min，5%乙腈；2～4 min，5%～15%乙腈；4～8 min，15%～19%乙腈；8～10 min，19%～20%乙腈；10～15 min，20%～38%乙腈）對當(dāng)歸、熟地黃、白芍、黨參、黃芪、麥冬、枸杞子及墨旱蓮分別與制首烏配伍的藥對樣品進(jìn)行分析，指認(rèn)出上述藥對配伍共煎樣品中歸屬于制首烏的12個色譜峰，色譜圖如圖1-A所示。因甘草成分復(fù)雜，梯度洗脫程序1難以滿足甘草-制首烏藥對樣品的分析，故采用梯度洗脫程序2（0～1 min，5%乙腈；1～4 min，5%～12%乙腈；4～10 min，12%～18%乙腈；10～15 min，18%～25%乙腈；15～25 min，25%～35%乙腈；25～40 min，35%～60%乙腈）對甘草-制首烏藥對進(jìn)行分析，指認(rèn)出甘草-制首烏藥對配伍共煎樣品中歸屬于制首烏的12個色譜峰，結(jié)合PDA檢測器所獲取的每個色譜峰的紫外光譜，其光譜圖分別與梯度洗脫程序1所獲得的12個色譜峰光譜圖一致，梯度洗脫程序2的色譜圖如圖1-B所示。通過制首烏單煎、藥對配伍共煎、每味配伍藥物單煎色譜圖的對比，結(jié)果表明通過梯度洗脫程序1和2，制首烏中12個色譜峰均可實(shí)現(xiàn)與其他色譜峰的基線分離。

表3 線性及范圍測定結(jié)果

2.3.4 方法學(xué)驗證

（1）線性關(guān)系考察：精密稱取首烏提取物凍干粉樣品適量，加入5 mL蒸餾水，超聲溶解30 min后3500 r/min離心20 min，取上清液0.22 μm微孔濾膜濾過，將續(xù)濾液連續(xù)稀釋為不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），各色譜峰峰面積響應(yīng)為縱坐標(biāo)（），繪制各成分的半定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表3所示，各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（）均大于0.997 2，表明線性關(guān)系良好，可用于各成分的定量分析。

（2）準(zhǔn)確度考察：經(jīng)質(zhì)譜及對照品對照，化合物8與11分別為-THSG與EG，以半定量分析法與傳統(tǒng)絕對定量法分別計算-THSG與EG 2種化合物的加樣回收率。配制質(zhì)量濃度范圍分別為10～500 μg/mL、0.22～6.94 μg/mL的系列- THSG與EG對照品溶液，并建立絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，-THSG標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝3 892 045.07＋30 376.39，＝0.999 6；EG標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝15 546.57＋1 098.12，＝0.999 9。稱量約0.05 g首烏提取物凍干粉，加入與凍干粉樣品中等量的-THSG與EG，加入5 mL蒸餾水，其他操作同“2.3.2”項下供試品溶液制備方法，平行配制3份。分別采用絕對定量與半定量法，按回收率＝(實(shí)測值－測定值)/加入值計算回收率，結(jié)果如表4所示。-THSG和EG半定量法的加樣回收率分別為95.09%、93.68%，均低于絕對定量法，RSD分別為3.2%、4.8%，均高于絕對定量法，表明半定量法準(zhǔn)確度低于絕對定量法。由于本研究擬通過半定量法對配伍前后成分含量的變化進(jìn)行比較分析，而非進(jìn)行絕對定量的測定，故認(rèn)為加樣回收率在90.00%～110.00%為可接受的范圍[13]。

表4 準(zhǔn)確度測定結(jié)果(n = 3)

（3）精密度考察：取同一供試品溶液，在同1 d內(nèi)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各組分峰面積，并計算RSD值。結(jié)果表明，RSD值均小于4%，9、10號色譜峰由于本身的響應(yīng)值較低，RSD值大于3%，其他色譜峰均小于3%，結(jié)果表明精密度符合本實(shí)驗的定量測定要求。

（4）重復(fù)性考察：按“2.3.2”項下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄各組分峰面積，并計算RSD值。結(jié)果表明，RSD均小于7%，符合本實(shí)驗的定量測定要求。

（5）穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于制備后的0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣分析，記錄各組分峰面積，并計算RSD值。結(jié)果表明RSD值均小于3%，表明測定過程中各成分較為穩(wěn)定。

2.3.5 藥對配伍對制首烏中各成分含量的影響作用研究 本實(shí)驗采用半定量分析法對制首烏分別與9味補(bǔ)虛藥配伍后其所含的12個成分的含量變化進(jìn)行比較分析。藥對配伍提取液中制首烏所含成分含量C-j（為藥對名稱，為峰編號）計算公式如下。

C-j＝m0d/(0V) （2）

m為依據(jù)公式（1）所計算出的供試品溶液中化合物的含量，0為供試品溶液制備中加入溶劑的體積，0為供試品溶液中所稱取的凍干粉質(zhì)量，d為提取液濃縮凍干后的凍干粉總質(zhì)量，V為提取液體積

采用公式（2）分別計算藥對配伍提取物中制首烏所含各化合物的含量，結(jié)果如表5所示。

采用SPSS 19.0軟件對12個成分在藥對配伍提取樣品中與在制首烏單獨(dú)提取樣品中的含量進(jìn)行檢驗，結(jié)果如表6所示，大部分成分含量發(fā)生顯著變化（＜0.05）。分別與當(dāng)歸、熟地黃、白芍3味補(bǔ)血藥配伍后，制首烏中的1、8、9、11、12號成分含量均顯著降低（＜0.05），7號成分含量顯著升高（＜0.05）；分別與黨參、黃芪、甘草3味補(bǔ)氣藥配伍后，制首烏中的8、9、11、12號成分含量均顯著降低（＜0.05），5號成分含量顯著升高 （＜0.05）；分別與麥冬、枸杞子2味補(bǔ)陰藥配伍后，制首烏中的6、8～12號成分含量均顯著降低（＜0.05），與麥冬配伍后無含量顯著升高的成分，在分別與枸杞子、墨旱蓮2味補(bǔ)陰藥配伍后，5號成分的含量均顯著升高（＜0.05）。

表5 半定量測定結(jié)果(, n = 3)

表6 配伍后制首烏成分含量變化分析結(jié)果

為更直觀地表示制首烏與9味藥物配伍后成分含量變化的整體情況，分別以含量顯著降低（＜0.05）、無顯著性變化（＞0.05）以及含量顯著增加（＜0.05）的成分?jǐn)?shù)量與所測成分的總個數(shù)的百分比繪制條形圖，以表示12個成分在其與9個藥對配伍提取過程中含量變化情況，如圖2-A所示；以log2(fold change)為橫坐標(biāo)，以檢驗顯著性檢驗值的負(fù)對數(shù)（?lg）為縱坐標(biāo)繪制首烏中各成分含量變化火山圖（volcano plot），如圖2-B所示，圖中以＝0.05為界限，在該界限上方的點(diǎn)即代表該成分在藥對提取過程中發(fā)生了顯著性變化，以log2(fold change)＝0為界限，以各成分的坐標(biāo)分別落在該界限的左側(cè)、右側(cè)代表配伍后相應(yīng)成分含量的降低、升高。根據(jù)圖2顯示，制首烏與當(dāng)歸、熟地黃等8味藥物配伍后成分含量的變化均以降低為主，與墨旱蓮配伍后成分含量的變化以升高為主，其中以11號成分在制首烏-黃芪藥對中含量降低最為顯著，以9號成分在制首烏-墨旱蓮藥對中含量升高最為顯著。

2.4 DPPH自由基清除能力測定

研究顯示，制首烏具有較強(qiáng)的抗氧化活性[3-5]。為進(jìn)一步研究藥對配伍后的藥理作用變化情況，本部分研究采用DPPH自由基清除法對藥對配伍后的抗氧化能力變化進(jìn)行測定。

圖2 配伍后制首烏成分含量變化分析圖(一覽圖, A;火山圖, B)

2.4.1 供試品溶液的配制 根據(jù)不同樣品DPPH自由基清除能力的不同，精確稱取適量提取物凍干粉，以蒸餾水超聲溶解30 min后取出，溫度降至室溫后，定容到50 mL量瓶，3500 r/min離心20 min，取上清液備用。

2.4.2 DPPH自由基清除能力的測定 配制0.04 mg/mL的DPPH溶液，以2 mL DPPH溶液及2 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液、2 mL樣品溶液及2 mL乙醇、2 mL DPPH溶液及2 mL乙醇配制不同混合溶液，分別于517 nm下測定其吸光度（A、A及0），平行3次。按照公式［清除率＝1－(A－A)/0］計算不同提取物的DPPH清除率。以清除率為縱坐標(biāo)，以提取物質(zhì)量濃度的對數(shù)值（lg）為橫坐標(biāo)，以Graphpad Prism 6軟件繪制樣品清除自由基的量-效曲線（圖3），并計算各樣品清除自由基的能力，采用半數(shù)有效濃度（EC50）值表示，即清除率為50%時所需樣品的質(zhì)量濃度，結(jié)果如表7所示。結(jié)果顯示，制首烏的EC50均小于其他9味中藥，提示制首烏DPPH自由基清除能力高于其他9味中藥。

如表7所示，制首烏分別與9味中藥配伍為藥對后的EC50均高于制首烏，且均低于相應(yīng)的配伍藥物單獨(dú)提取樣品，這一結(jié)果可以通過圖3更直觀地看出，即配伍后9個制首烏藥對的量-效曲線較制首烏曲線右移，較相應(yīng)的配伍藥物的量-效曲線左移，表明制首烏藥對的自由基清除能力低于制首烏，但高于相應(yīng)的配伍藥物。

圖3 DPPH自由基清除量-效擬合曲線

表7 DPPH自由基清除結(jié)果

2.5 量-效關(guān)系擬合

2.5.1 正交偏最小二乘法（orthogonal projections to latent structures，OPLS）模型的建立 為進(jìn)一步研究制首烏中各成分含量對抗氧化活性的影響，本研究以表7中制首烏及9個制首烏藥對的EC50值為值，以制首烏中12個成分的半定量分析結(jié)果為變量（1～12），采用SIMCA-P 14.1軟件建立OPLS回歸模型。模型中共提取5個主成分，2X與2Y的值分別為0.841、0.981，即可反映84.1%的變量的信息及98.1%的變量的信息，且2＝0.962，表明該模型具有極好的預(yù)測能力。

采用置換檢驗（permutation test）對模型進(jìn)行驗證，結(jié)果如圖4-A所示，2在軸截距為0.189，小于0.4，2在軸截距為?0.626，小于0.5，表明模型未出現(xiàn)過擬合。根據(jù)變量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP），如圖4-B所示，變量的VIP值反映了對模型擬合的貢獻(xiàn)水平，以VIP值＞1的變量為影響提取物抗氧化活性標(biāo)志物，即色譜峰編號為8、12、7、11的化合物。

2.5.2 標(biāo)志物的定性分析 采用LC-MS對標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，采用“2.3.3”項下的色譜梯度洗脫程序1進(jìn)行分離，質(zhì)譜條件如下：離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度400 ℃，脫溶劑氣體體積流量600 L/h，毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓40 V，采用正、負(fù)離子模式，掃描范圍/100～1000。以甲酸鈉溶液作為內(nèi)標(biāo)校正。結(jié)果見表8。

對于7號化合物與8號化合物來說，通過分析正離子/407 [M＋H]+和負(fù)離子/405 [M－H]?，確定其相對分子質(zhì)量均為406，進(jìn)一步結(jié)合正、負(fù)離子模式下碎片峰均為分子離子丟失1分子葡萄糖基（/162）產(chǎn)生離子碎片峰/245 [M＋H－glu]+、243 [M－H－glu]?，判斷7號化合物與8號化合物極可能為同分異構(gòu)體。根據(jù)液相色譜對照品的保留時間，確認(rèn)8號化合物為-THSG，其裂解途徑如圖5-A所示。結(jié)合文獻(xiàn)，-THSG經(jīng)光照后其可發(fā)順反異構(gòu)變化轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖浇Y(jié)構(gòu)[17]。因順式結(jié)構(gòu)無商品化的對照品，為進(jìn)一步確證7號化合物的結(jié)構(gòu)，將-THSG甲醇溶液置于光照環(huán)境下2 h后，8號化合物（-THSG）對應(yīng)的色譜峰峰面積降低，同時7號化合物對應(yīng)的色譜峰峰面積明顯升高，因此，確定7號化合物為-THSG，其裂解途徑如圖5-a所示。

圖4 OPLS模型置換檢驗圖(A)和分析變量VIP圖(B)

表8 標(biāo)志物鑒定結(jié)果

11號化合物的正離子/455 [M＋Na]+、負(fù)離子/431 [M－H]?判斷其相對分子質(zhì)量為432，正離子模式下加鈉離子丟失1分子葡萄糖基及鈉離子，形成碎片離子峰/271 [M＋H－glu]+，負(fù)離子模式下分子離子峰丟失1分子葡萄糖基，形成碎片離子峰/269[M－H－glu]?，結(jié)合液相色譜中EG對照品的保留時間，確定11號化合物為EG，其裂解途徑如圖5-b所示。

12號化合物的正離子/285 [M＋H]+、負(fù)離子/283 [M－H]?判斷其相對分子質(zhì)量為284，負(fù)離子模式下失去碎片/43，何首烏中主要含有二苯乙烯苷及蒽醌類物質(zhì)[18]，且蒽醌母核在離子碰撞中易失去母核基團(tuán)中的CO并留存共軛體系是其主要的裂解方式，判斷碎片離子峰/240為分子離子/283 [M－H]?丟失1分子CO以及1分子CH3所形成，其失去的CH3應(yīng)該是其側(cè)鏈取代基，結(jié)合文獻(xiàn)報道確定12號化合物為大黃素甲醚[18-19]，其裂解途徑如圖5-c所示。

a-7、8號化合物裂解途徑 b-11號化合物裂解途徑 c-12號化合物裂解途徑 I-trans-THSG對照品甲醇溶液色譜圖 II-trans-THSG對照品甲醇溶液光照2 h后色譜圖

a-fragmentation pathway of No. 7 compound and No. 8 compound b-fragmentation pathway of No. 11 compound c-fragmentation pathway of No. 12 compound I-chromatography of methanol solution of trans-THSG reference substance II-chromatogram of methanol solution of trans-THSG reference substance after 2 h illumination

圖5 標(biāo)志物結(jié)構(gòu)解析

Fig. 5 Structural analysis of markers

3 討論

中藥藥對是中醫(yī)臨床遣藥組方常用的配伍形式[20-21]，其配伍過程中成分含量變化是中藥配伍機(jī)理研究的重要組成部分。由于中藥中成分復(fù)雜多樣、且對照品不易獲取，因此難以對諸多成分進(jìn)行含量測定是中藥成分定量分析的瓶頸。參照文獻(xiàn)所提出的單味藥標(biāo)定的半定量分析法[13]，本實(shí)驗對制首烏分別與9味補(bǔ)虛藥配伍后12個化學(xué)成分的含量變化進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示配伍后制首烏中的大部分成分含量顯著降低，僅有少數(shù)化合物含量顯著增加。其中部分化合物的含量變化具有一定的規(guī)律，其規(guī)律可能對于深入研究制首烏與補(bǔ)虛藥的配伍機(jī)理有提示作用，如8、10、12號色譜峰對應(yīng)的化合物在制首烏與上述9味藥物配伍后含量均顯著降低。結(jié)合DPPH自由基清除作用的量-效回歸分析中顯示，8、12號色譜峰對應(yīng)的化合物亦是影響配伍后藥對抗氧化能力的標(biāo)志物，其分別為- THSG、大黃素甲醚。本實(shí)驗是以制首烏配伍過程中其所含成分的含量變化為核心展開的研究，研究結(jié)果顯示制首烏中各化合物的含量變化與藥對自由基清除能力間存在回歸關(guān)系，但是，藥對配伍共煎過程中，與制首烏配伍的藥物中所含的成分含量亦可能發(fā)生改變，其成分的改變情況及其與抗氧化能力的關(guān)系可基于本實(shí)驗半定量分析的思維方法進(jìn)一步進(jìn)行比較，將有助于快速篩選出配伍量-效關(guān)系的標(biāo)志物，從而進(jìn)行配伍機(jī)理的深入研究。

各化學(xué)成分在藥物合煎與單煎間的含量差異除受到配伍的影響外，還受到提取溶劑體積影響，如藥物配伍合煎可采用2種方法計算溶劑體積，一種是以各單味藥的質(zhì)量之和計算料液比的等倍數(shù)法，一種是保持單煎與合煎的溶劑體積一致的等體積法[22]。本研究采用的是等體積法，是因為考慮到中藥在臨床實(shí)際應(yīng)用時的煎煮過程中不會因為其配伍藥物而相應(yīng)的將加水量翻倍增加，而是根據(jù)配伍藥物的吸水量及最終期望的得液量而調(diào)整加水量[23]。為降低溶液體積對部分成分溶出的影響，采用了高于常用10倍（或8倍）液料比的20倍體積，并在該體積外額外加入相應(yīng)藥物吸水量，以保證制首烏在單煎、配伍共煎過程中溶劑體積的一致性。但等倍數(shù)法與等體積法對各成分含量的影響差異還有待進(jìn)一步通過實(shí)驗進(jìn)行對比。

成分含量的變化是藥物配伍與“單行”間藥理活性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗基于建立的半定量分析方法對制首烏與不同補(bǔ)虛藥配伍共煎過程中成分含量及抗氧化能力變化進(jìn)行分析，并通過建立量-效回歸模型篩選出4個化學(xué)標(biāo)志物，分別為順式二苯乙烯苷、大黃素甲醚、反式二苯乙烯苷以及EG。以期通過本研究為制首烏與補(bǔ)虛藥配伍機(jī)制的深入研究提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on change of ingredients content and DPPH free radical scavenging activity of drug pairs withbased on semi-quantitative analysis

ZHANG Hui-jie1, REN Xiao-liang2, SUN Hao1, WANG Ya-qi1, WANG Lei1, LIANG Ying1, ZHANG Yu1, LIU Yan1

1. Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital, Tianjin 300120, China 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To study the changes of ingredients content and DPPH free radical scavenging activity of(PMRP) combined with nine tonic herbs by semi-quantitative analysis.The semi-quantitative analysis method of multiple components was established by UPLC-DAD, and the method was used to analyze the changes of components of PMRP while it was compatible with nine tonic herbs [Danggui (), Shudihuang (), Baishao (), Dangshen (), Huangqi (), Gancao (et), Maidong (), Gouqizi (), and Mohanlian ()]. DPPH method was used to determine the free radical scavenging activity of single drug and herb pair. The dose-effect curves were drawn and the half scavenging concentration (EC50) of each sample was calculated. Then, a quantity-effect regression model was established by multivariate statistical analysis. The chemical markers of quantity-effect relationship were screened in the model and qualitatively analyzed by mass spectrometry.The results of five validation methods, namely linearity and range, accuracy, precision, repeatability and stability, showed that the proposed semi-quantitative analysis method was suitable for the quantitative analysis of 12 components in PMRP. The results of content analysis showed that the content of 12 components changed in varying degrees. The content of 33% of 12 components in PMRP was decreased significantly (< 0.05) and the content of 42% of 12 components was increased significantly (< 0.05) after being combined with. In combination with eight other medicines, at least 50% of 12 components were significantly lower (< 0.05) than in PMRP. The results of antioxidant test showed that the DPPH free radical scavenging ability of PMRP was higher than that of other nine medicines, DPPH free radical scavenging ability of 9 herb pairs was lower than that of PMRP, but higher than that of nine corresponding tonic herbs. A quantity-effect OPLS regression model was established, the value of2X,2Yand2of the model was 0.841, 0.981 and 0.962, respectively. Four chemical markers of quantity-effect relationship were selected and were qualitatively analyzed, namely-2,3,5,4′-tetrahydroxy styrene-2--β-- glucoside, physcion (-THSG),-2,3,5,4′-tetrahydroxy styrene-2--β--glucoside (-THSG), emodin-8--β--glucoside (EG).The-quantitative analysis method established in this paper can be used to study the changes of ingredients content of PMP while it was compatible with nine tonic herbs. And-THSG, physcion,-THSG, EG were the chemical markers of quantity and DPPH free radical scavenging activity of PMP in 9 herb pairs.

; herb pairs; tonic herbs; semi-quantitative analysis; DPPH method; free radical scavenging activity;;;;;;et;;;; multivariate statistical analysis; chemical marker;-2,3,5,4′-tetrahydroxy styrene-2--β--glucoside; physcion;-2,3,5,4′-tetrahydroxy styrene-2--β--glucoside; emodin-8--β--glucoside

R286.02

A

0253 - 2670(2021)07 - 1924 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.009

2020-11-09

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2017YFC1703400）；天津市科技計劃項目（17ZXMFSY00030）；天津市衛(wèi)生健康委員會、天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題青年項目（2019025）；天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題面上項目（13024）；天津市衛(wèi)生健康委員會中醫(yī)藥重點(diǎn)領(lǐng)域科研項目（2019002）

張慧杰，博士，主管藥師，從事中藥分析相關(guān)研究。Tel: (022)27339599 E-mail: jyhuijie@163.com

梁 穎，碩士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，從事中藥學(xué)、臨床藥學(xué)相關(guān)研究。Tel: (022)27339599 E-mail: tjszyyyxb_ly@163.com

張 宇，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，從事中醫(yī)外科學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究。Tel: (022)27345050 E-mail: niuniuzy7375@aliyun.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]