木蝴蝶素抗膿毒癥潛在靶標(biāo)的篩選與鑒定

陳 意，章玲玲，葉佳麗，陳桂榮，陳賽貞，徐煜彬

0 引言

膿毒癥是由于宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致生命器官功能障礙[1]。膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)入院的主要原因之一，也是危重患者急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙的主要原因。流行病學(xué)研究表明，住院患者膿毒癥的發(fā)病率很高，在2011年，有57 000例嚴(yán)重膿毒癥患者被收入124家美國(guó)學(xué)術(shù)醫(yī)院，其中69%需要入住ICU，在過(guò)去10年，膿毒癥是非心臟重癥監(jiān)護(hù)病房的第2位死亡原因，醫(yī)院死亡率為47%[2-6]。隨著對(duì)膿毒癥流行病學(xué)、生理機(jī)制等深入研究，嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者死亡率逐年降低[7]，但是到目前為止，對(duì)于膿毒癥并無(wú)特效藥，尋找膿毒癥有效藥物是目前急需任務(wù)之一。

木蝴蝶素(圖1)是從黃芩中提取的一種生物活性類黃酮，也是黃連解毒湯中抗膿毒癥的有效成分之一[8]。研究表明，木蝴蝶素具有多種藥理功能，包括抗氧化應(yīng)激、抗轉(zhuǎn)移、抗細(xì)胞衰老、抗肝脂肪變性、抗炎等[9-12]。木蝴蝶素在抗氧化抗炎的同時(shí)，對(duì)肝臟等器官具有保護(hù)作用，而這些作用可能會(huì)改善膿毒癥癥狀，起到抗膿毒癥作用，但是木蝴蝶素抗膿毒癥的作用靶標(biāo)及機(jī)制尚不明確。因此，本文基于網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)，采用靶標(biāo)預(yù)測(cè)及驗(yàn)證的方法，對(duì)木蝴蝶素抗膿毒癥的潛在靶標(biāo)進(jìn)行篩選與分析[13-15]。

圖1 木蝴蝶素化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料

木蝴蝶素sdf格式文件，中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，Swiss Targetprediction服務(wù)器(http://www.swisstargetprediction.ch)，DRAR-CPI服務(wù)器(https://cpi.bio-x.cn/drar)，分子對(duì)接服務(wù)器(http://systemsdock.unit.oist.jp)。

2 方法

2.1 藥理參數(shù)和分子特性評(píng)價(jià)及靶標(biāo)預(yù)測(cè) 首先通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)木蝴蝶素體內(nèi)過(guò)程的ADME(吸收、分布、代謝和排泄)以及分子特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.2 DRAR-CPI 靶標(biāo)預(yù)測(cè) DRAR-CPI服務(wù)器(https://cpi.bio-x.cn/drar)可以通過(guò)化學(xué)蛋白質(zhì)相互作用分析來(lái)預(yù)測(cè)化學(xué)成分的靶向蛋白，通過(guò)從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載木蝴蝶素(PubChem CID：5320315)的sdf文件，將其上傳到DRAR-CPI服務(wù)器，參數(shù)為默認(rèn)值，篩選Z′-score<-0.5的靶向蛋白。

2.3 Swiss Targetprediction靶標(biāo)預(yù)測(cè) 登陸Swiss TargetPrediction (http://www.swisstargetprediction. ch/)服務(wù)器，在Marvin for JavaScript Version 6.1上參照PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)木蝴蝶素(PubChem CID：5320315)結(jié)構(gòu)上傳，對(duì)其進(jìn)行靶標(biāo)篩選。

2.4 木蝴蝶素抗膿毒癥靶標(biāo)預(yù)測(cè) 將DRAR-CPI及Swiss Targetprediction服務(wù)器預(yù)測(cè)到共有的木蝴蝶素靶向蛋白作為潛在靶標(biāo)信息，與OMIM(http://www.omim.org/)、CTD(https://ctdbase.org/)和TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的與膿毒癥相關(guān)疾病靶標(biāo)進(jìn)行匹配，選擇既是木蝴蝶素靶標(biāo)蛋白又是膿毒癥的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行后續(xù)分析。

2.5 分子對(duì)接 首先將“2.1”和“2.2”涉及到的相關(guān)蛋白PDB ID輸入到分子對(duì)接服務(wù)器(https://www.dockingserver.com/web/docking)，再將木蝴蝶素的sdf文件上傳到服務(wù)器，點(diǎn)擊開始對(duì)接，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 藥理參數(shù)和分子特性評(píng)價(jià) 掌握化合物的藥理參數(shù)與特性能夠深入地了解該化合物的成藥性能，明確合適的劑型，能減少藥物研發(fā)前期大量篩選操作。木蝴蝶素口服生物利用度(OB)為41.37%(>30%)，藥物相似度(DL)為0.23(>0.18)，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(RBN)為2，表明木蝴蝶素口服吸收較好，具有良好的成藥性[11]。而藥物半衰期(HL)為17.15，半衰期較長(zhǎng)，能維持長(zhǎng)時(shí)間的療效，可以考慮做成一般口服制劑。木蝴蝶素的分子量(MW)為284.28(<500)，油水分配系數(shù)(AlogP)為2.59 (<5)，氫鍵供體(Hdon)為2,氫鍵受體(Hacc)為5,均接近5，與Lipinski[16]的5原則較為一致，成藥可能性較高。

3.2 靶標(biāo)預(yù)測(cè) 靶標(biāo)預(yù)測(cè)是新藥開發(fā)的第一步，如何明確篩選化合物的靶向蛋白已經(jīng)成為藥物開發(fā)的核心問題。分子反向預(yù)測(cè)靶標(biāo)的計(jì)算釣靶方法也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于這一目的。從Swiss Targetprediction服務(wù)器篩選得到木蝴蝶素的相關(guān)靶標(biāo)15個(gè)；通過(guò)DRAR-CPI共篩選出388個(gè)靶標(biāo)，其中Z′<-0.5的靶標(biāo)共有88個(gè)，Z′<-0.5表明具有良好的靶向性；將Swiss Targetprediction服務(wù)器和DRAR-CPI篩選到的靶標(biāo)合并，刪除重復(fù)靶標(biāo)，總共得到97個(gè)靶標(biāo)。

將“sepsis”輸入到CTD、OMIM以及TTD3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，從CTD篩選到26個(gè)靶標(biāo)蛋白，OMIM篩選到117個(gè)靶標(biāo)蛋白，TTD篩選到21個(gè)蛋白，其中共有疾病靶標(biāo)149個(gè)，將木蝴蝶素預(yù)測(cè)到的97個(gè)靶標(biāo)蛋白與疾病靶標(biāo)進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)既是分子靶標(biāo)又是疾病靶標(biāo)的蛋白有9個(gè)，分別為SERPINE1、CTSG、MIF、PROC、F9、NOS3、NOS2、ADORA1和ADORA2A，具體篩選流程見圖2。

圖2 木蝴蝶素靶標(biāo)鑒定流程圖

3.3 分子對(duì)接 本實(shí)驗(yàn)采用dockingserver分子對(duì)接服務(wù)器對(duì)木蝴蝶素和相關(guān)蛋白進(jìn)行了分子對(duì)接。結(jié)果顯示，自由結(jié)合能小于-5 kcal/mol的靶標(biāo)有PROC、CTSG、MIF、NOS3、NOS2、F9、ADORA2A和ADORA1，表明木蝴蝶素具有結(jié)合這些靶標(biāo)的能力[17]，結(jié)果見表1。

表1 木蝴蝶素與靶標(biāo)蛋白相互作用分子對(duì)接數(shù)據(jù)

圖3 木蝴蝶素與NOS3和NOS2分子相互作用

從圖3可見，木蝴蝶素與NOS3的疏水相互作用殘基包括ASN366、GLN247、GLU361、TYR357、PRO334、VAL336、ARG372；木蝴蝶素與NOS2的疏水相互作用殘基包括ARG381、TRP463、ILE462、MET120、PHE476、TRP461、TRP90、GLU479、SER118，表明木蝴蝶素可能通過(guò)這些關(guān)鍵殘基與NOS3和NOS2產(chǎn)生交互作用，從而發(fā)揮相應(yīng)的藥效。

膿毒癥是一種危及生命的器官功能障礙，是由于宿主對(duì)入侵病原體的反應(yīng)失調(diào)所致，其特征可能是全身炎癥或某種免疫麻痹，嚴(yán)重者常常伴隨著急性肺損傷，微循環(huán)障礙，細(xì)胞病變性缺氧，以及心功能障礙等[18-19]。盡管隨著膿毒癥機(jī)制研究的深入，開展了治療創(chuàng)新，但是嚴(yán)重膿毒癥以及膿毒癥休克患者的死亡率仍然很高[20]，仍然需要尋找更多有效的治療措施去攻克這一難題。本研究發(fā)現(xiàn)，木蝴蝶素可能通過(guò)結(jié)合PROC、CTSG、MIF、NOS3、NOS2、F9、ADORA2A和ADORA1起到抗膿毒癥的作用。

PROC和F9都屬于凝血因子，參與機(jī)體的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，也是血管內(nèi)彌散性凝血的生物標(biāo)志物，在維持血液通透性和調(diào)節(jié)抗凝方面發(fā)揮著重要作用[21-22]，同時(shí)，PROC也是重要的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物[23]，而在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中常常伴隨著凝血功能紊亂以及內(nèi)皮組織的損傷，因此，這兩者與膿毒癥密切相關(guān)，更為重要的是，PROC的水平也反映了膿毒癥患者的預(yù)后情況[24]。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)是一種與急性和慢性炎癥包括膿毒癥、自身免疫性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、斑塊不穩(wěn)定和肺動(dòng)脈高壓有關(guān)的促炎細(xì)胞因子，也是免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子[25]，其能促進(jìn)炎癥、增殖和血管生成物活性，參與感染性、炎癥性以及自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，并且在膿毒癥患者中高表達(dá)，也被認(rèn)為是膿毒癥的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物[26]。

膿毒癥是由內(nèi)毒素釋放引發(fā)的炎癥反應(yīng)，常進(jìn)展為難治性低血壓，多器官系統(tǒng)衰竭和死亡。炎癥反應(yīng)通常是通過(guò)巨噬細(xì)胞活化和促炎細(xì)胞因子的釋放來(lái)介導(dǎo)的，在這些信號(hào)級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)的介質(zhì)中，NO是低血壓和末端器官損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而NO的生成則依賴于一氧化氮合成酶NOS2和NOS3[27-28]。此外，NOS2可誘導(dǎo)心肌抑制，NOS3可拮抗心肌抑制，兩者相互平衡，在膿毒癥發(fā)生心肌抑制病理生理發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[29]。CTSG是一種中性粒細(xì)胞蛋白彈性酶，功能類似殺菌劑，可以導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷，膿毒癥發(fā)展中的器官損傷可能是由于亞毒氧化劑(超氧化物、NO等)與大量膜穿孔劑(溶血素、陽(yáng)離子蛋白等)協(xié)同作用引起的，而CTSG作為亞毒性蛋白可以極大地增加這種損傷[30-31]。研究表明，腺苷受體作為炎癥調(diào)控靶標(biāo)是一個(gè)非常好的選擇，ADORA1和ADORA2A均是G蛋白偶聯(lián)受體，在機(jī)體組織細(xì)胞中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，調(diào)控免疫應(yīng)答，在膿毒癥發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用，如抑制ADORA1能降低白細(xì)胞吞噬和產(chǎn)生氧自由基的能力，ADORA1基因缺陷會(huì)導(dǎo)致促炎因子水平降低，而ADORA2A激活PKA，產(chǎn)生抗炎作用，在藥理學(xué)上靶向治療炎癥、膿毒癥、癌癥、神經(jīng)變性和帕金森病[32-34]。

綜上所述，木蝴蝶素可能通過(guò)調(diào)節(jié)PROC和F9促進(jìn)凝血系統(tǒng)恢復(fù)；通過(guò)調(diào)節(jié)MIF、ADORA1和ADORA2A調(diào)控免疫應(yīng)答發(fā)揮抗炎作用；通過(guò)調(diào)節(jié)CTSG、NOS2和NOS3，起到保護(hù)膿毒癥損傷器官的作用，最終通過(guò)緩解膿毒癥整體癥狀和炎癥等水平起到抗膿毒癥作用。本研究主要通過(guò)現(xiàn)有的大數(shù)據(jù)對(duì)木蝴蝶素抗膿毒癥的靶標(biāo)進(jìn)行了篩選與鑒定，但是由于數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算方法的缺陷，并不能確定木蝴蝶素潛在劑量的效應(yīng)結(jié)果，盡管這些靶標(biāo)已通過(guò)分子對(duì)接證實(shí)，但是仍需要通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，但是盡管如此，本研究所使用的方法可以節(jié)約資源，減少大量靶標(biāo)的篩選步驟，有助于快速有效識(shí)別木蝴蝶素的藥物靶標(biāo)。