楊佳琪段小鳳徐小茜田建霞郭建軍

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2. 貴州大學(xué)昆蟲研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

九香蟲作為傳統(tǒng)藥用昆蟲已多次出現(xiàn)在臨床藥用上，近年來其對腫瘤細(xì)胞特有的功效引發(fā)學(xué)者們研究熱潮，諸多學(xué)者對九香蟲引起腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究，結(jié)果證明，九香蟲可引起腫瘤細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)行試驗(yàn)研究[1,2]。故本試驗(yàn)采用特異性強(qiáng)以及靈敏性較好的熒光定量PCR方法從mRNA上檢測九香蟲血淋巴液作用于腫瘤細(xì)胞以后凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，以此探究九香蟲血淋巴液引起腫瘤凋亡的機(jī)制。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器與試劑見表1。

表1 主要儀器與試劑

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試細(xì)胞的處理

分別培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞至指數(shù)生長期，采取倍比稀釋方法，使得2種細(xì)胞濃度至107個·mL-1。具體處理濃度及加樣體積見表2，放置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，利用0.25%的胰酶進(jìn)行消化后，使用PBS緩沖液洗滌腫瘤細(xì)胞2遍。

表2 九香蟲血淋巴處理

1.2.2 制備RNA及測定其濃度

利用TRIzol方法制取腫瘤細(xì)胞RNA，并對RNA完整性進(jìn)行測定，條件控制設(shè)定為110V，20min。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成

選用life technology公司設(shè)計(jì)與合成的引物，見表3。

表3 引物

1.2.4 去基因組DNA和cDNA的合成

按照表2中順序于冰上進(jìn)行基因組DNA的反應(yīng)液配置操作，將PCR儀條件設(shè)為42℃,2min，而后終止反應(yīng)，于4℃的冰上驟冷,反應(yīng)條件見表4。

表4 去基因組DNA反應(yīng)(10μL體系)

按照表5中順序于冰上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)液配置，PCR儀條件控制為37℃、15min，而后85℃、5s進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶的滅活，最后使反應(yīng)終止，放于4℃的冰水進(jìn)行驟冷，反應(yīng)條件見表6。利用RNase-free Water使cDNA稀釋5倍，-20℃進(jìn)行保存。

表5 反應(yīng)條件

表6 反轉(zhuǎn)錄(20μL體系)

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR

各個樣本的對應(yīng)目的基因及內(nèi)參基因重復(fù)3孔。按照表7中順序進(jìn)行試劑的配置，反應(yīng)條件可見表8。

表7 反應(yīng)條件

表8 熒光定量PCR的操作體系(20μL)

表9 反應(yīng)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA電泳圖及RNA濃度測定

根據(jù)表10樣品順序上樣，方法選用瓊脂糖凝膠電泳(DL2000 Marker)，圖1所示18s條帶及28s條帶明顯，5s較為模糊，從而確定RNA完整性的檢測結(jié)果合格。將提取的完整RNA進(jìn)行DNaseI處理后，利用PCR擴(kuò)增測定所獲取的RNA不存在污染，能用于后續(xù)試驗(yàn)。

表10 凝膠電泳樣品順序

2.2 溶解曲線

由圖2的溶解曲線可看出，該P(yáng)CR產(chǎn)物的引物特異性相對較好；圖3的擴(kuò)增曲線顯示PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。

2.3 各樣品相關(guān)凋亡基因的表達(dá)

采用實(shí)時熒光定量PCR方法對2種腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因進(jìn)行檢測，了解其變化，結(jié)果以RQ(2-△△Ct)進(jìn)行表示，結(jié)果見圖4。經(jīng)血淋巴液處理后的2種腫瘤細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9與Bax基因mRNA表達(dá)較CK組顯著上調(diào)，而Bcl-2基因的表達(dá)較CK組顯著下調(diào)。另由圖4可見，當(dāng)血淋巴液濃度為2.65mg·L-1時，Caspase-8的表達(dá)比濃度為12.26mg·L-1時低；當(dāng)血淋巴液的濃度為12.26mg·L-1，Caspase-8的表達(dá)和CK組結(jié)果更為接近，但僅從表11的結(jié)果，不能排除可能經(jīng)過外源性凋亡通路及內(nèi)源性凋亡通路的相互作用，從而使腫瘤細(xì)胞走向凋亡，后續(xù)仍需針對血淋巴液誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行深入研究[3-5]。

表11 相關(guān)凋亡基因數(shù)據(jù)處理