盧俊玲　尤燕舞

[專家介紹]尤燕舞，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，博士生導師，學術帶頭人。曾在美國洛杉磯Cedars Sinai醫(yī)學中心擔任博士后研究員。主要從事慢性腎臟疾病的基因、免疫及分子機制的研究。現(xiàn)任中國僑聯(lián)特聘專家、廣西醫(yī)學會腎臟病學分會常務委員、廣西醫(yī)師協(xié)會腎臟內(nèi)科醫(yī)師分會常務委員、廣西中西醫(yī)結合腎臟病學會常務委員、廣西醫(yī)學會百色市腎臟病學分會副主任委員，百色市第四屆政協(xié)委員，2012年入選“廣西高校優(yōu)秀人才計劃”，先后獲得“百色市專業(yè)技術拔尖人才”“中國僑界貢獻獎”“優(yōu)秀教師”“廣西十佳青年醫(yī)師”“十佳醫(yī)德標兵”“教學名師”等榮譽稱號。主持在研國家自然科學基金2項、廣西自然科學基金4項、廣西高校科研重點項目1項，主持完成廣西高等教育教學改革研究課題1項。在國際、國內(nèi)知名期刊公開發(fā)表論著80多篇。榮獲廣西科技進步二等獎、三等獎各1項，廣西醫(yī)藥衛(wèi)生適宜技術推廣三等獎1項，百色市科技創(chuàng)新二等獎1項。

【摘要】 外泌體是由B細胞、T細胞等細胞釋放并存在不同體液中的外囊泡，其攜帶的蛋白質(zhì)可以在細胞間轉運，參與細胞的通信、物質(zhì)轉運以及生化組成，是目前精準醫(yī)學的研究熱點。外泌體蛋白質(zhì)在多種人類疾病診療中占有重要地位，而腎臟疾病具有發(fā)病機制復雜、診斷難等特點，所以腎臟穿刺仍是診斷腎臟疾病的金標準，但因為屬于侵入性操作故不作為診斷的首選檢查，外泌體蛋白質(zhì)組學分析則能精準地鑒定出多種蛋白質(zhì)生物標志物，并且能較好地運用在腎臟疾病的診療中。該文通過不同方面討論外泌體蛋白組學分析在腎臟疾病研究中的最新進展，有望為腎臟疾病的診療提供新思路。

【關鍵詞】 外泌體;蛋白質(zhì)組學;腎臟疾病

中圖分類號：R692? 文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.02.001

【Abstract】 ? Exosomes are vesicles released by B cells， T cells and other cells and exist in different body fluids. Proteins carried by exosomes can be transported between cells， participate in cell communication， material transport and biochemical composition. This has become a research hotspot of precision medicine. Exosomes play an important role in the diagnosis and treatment of various human diseases， while kidney diseases， because of their complicated pathogenesis and difficult diagnosis， renal puncture is still the gold standard for the diagnosis of them. However， because of its invasive operation， it is not the first choice for diagnosis of renal diseases. Exosomes proteomics analysis can accurately identify a variety of protein biomarkers， and it can be better used in the diagnosis and treatment of renal diseases. Therefore， this review discusses the latest progress of exosomes proteomic analysis in kidney disease research from different aspects， which is expected to provide new ideas for the diagnosis and treatment of kidney disease.

【Key words】?exosomes; proteomics; kidney diseases

隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，腎臟疾病的高發(fā)病率及死亡率已成為目前重大公共衛(wèi)生問題之一[1]，對腎臟疾病進行早期診斷及早期治療尤為重要。血液和尿液檢查仍是臨床診斷腎臟疾病的首選，根據(jù)當前腎臟疾病改善全球預后KDIGO指南，診斷和風險分層主要是功能性標志物：肌酐和胱抑素C，腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）和分析尿白蛋白排泄作為腎臟損害的主要標志物[2]，但是這些體液檢驗通常因不夠靈敏或特異性不足，難以作出明確的診斷。目前影像學檢查在腎臟疾病的診斷中僅發(fā)揮有限的作用，主要用于診斷腎結石或大體解剖缺陷，如囊性疾病、惡性腫瘤和阻塞性腎病。重要的是，影像檢查使用的造影劑拓寬了腎臟成像診斷的范圍，同時也增加了腎毒性的可能。因此，腎臟穿刺仍是診斷腎臟疾病的金標準，但這種診斷操作具有侵入性，并伴有各種并發(fā)癥，出血是其最大危害[3]，因此不適合在腎臟疾病診斷及監(jiān)測預后中多次使用，故腎臟疾病的診斷及預后監(jiān)測迫切需要新的生物標志物來敏感、特異地檢測腎臟損傷并實現(xiàn)靶向治療。外泌體蛋白質(zhì)組學分析能精準地鑒定出多種疾病的蛋白質(zhì)生物標志物，如癌癥[4～5]、自身免疫性疾病[6]等，近年來，不少研究發(fā)現(xiàn)外泌體蛋白能較好地運用于腎臟疾病的診療中，因此，從不同方面討論外泌體蛋白組學分析在腎臟疾病研究中的最新進展，有望為腎臟疾病的診療提供新思路。

1?外泌體蛋白作為生物標志物載體的優(yōu)勢

外泌體由B細胞、T細胞、腫瘤細胞等細胞釋放并存在于血液[7]、尿液[8]、腦脊液[9]、羊水[10]等不同體液中納米大?。?0～150納米）的外囊泡（External vesicle，EV）。在保持轉移物質(zhì)的生物活性的前提下，外泌體攜帶穩(wěn)定的組織特異性蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉移至特定的靶細胞，改變靶細胞的生化組成以及信號通路[11～13]，同時以細胞間通信的一種新形式，以及運載工具，重新編程靶細胞來調(diào)節(jié)其生理及病理過程[14]，因此外泌體可以代表靶細胞的現(xiàn)階段的狀態(tài)。

外泌體蛋白比傳統(tǒng)的血清學標志物具有獨特的功能，首先，與直接在血液中檢測到的蛋白質(zhì)相比，外泌體蛋白質(zhì)具有更高的敏感性，致死性全身照射小鼠的尿總蛋白質(zhì)組學與尿外泌體蛋白質(zhì)組學之間的比較，在尿外泌體鑒定出23種差異蛋白質(zhì)[15]。第二，外泌體蛋白高度穩(wěn)定，脂質(zhì)雙層可保護外泌體蛋白免受外部蛋白酶和其他酶的侵害，磷酸化蛋白可與冷凍5年的外泌體樣品分離[16]。第三，蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）是一種分解生命活動的重要翻譯后修飾，替代生物的生長發(fā)育，信號轉導，以及疾病的發(fā)生發(fā)展，可以改變蛋白質(zhì)結構和活性，介導細胞信號轉導，對外部環(huán)境刺激的響應往往通過PTM實現(xiàn)。PTM有許多形式，而磷酸化是最受矚目的[17]。所以，使用外泌體蛋白質(zhì)作為生物標志物及治療的載體是理想的，這允許最低限度地采用非侵入性“液體活檢”的方法來診斷甚至監(jiān)測疾病發(fā)展。

2?外泌體蛋白的質(zhì)譜分析技術

在1994年第一屆國際雙向電泳大會上，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins首次提出蛋白質(zhì)組這個概念。目前， 基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry LC-MS /MS）的定量蛋白質(zhì)組學技術飛速發(fā)展，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學研究的主要分析手段。定量分析可以是絕對的也可以是相對的，實際上，MS的許多生化應用都依賴于相對定量，而相對定量則分為非標記定量技術及穩(wěn)定同位素標記定量技術。2.1?非標記定量技術?非標記定量技術主要的方法如下：一種是基于質(zhì)譜峰的峰面積或峰強度來進行定量[18]，另外一種是基于蛋白的肽段鑒定數(shù)來進行定量[19]。近年來，基于質(zhì)譜的非標記定量技術隨著其數(shù)據(jù)處理軟件和程序的不斷開發(fā)，該技術得到了較廣泛的應用，如SAINT-MS1[20]、RIPPER[21]。非標記定量技術少了標記步驟，減少了標記時導致的誤差，而且因為每個樣品是分開進行分析的，所以解決了分析樣品數(shù)量的煩惱，甚至可以實現(xiàn)同時多組生物樣品的高通量定量分析。

2.2?穩(wěn)定同位素標記定量技術?蛋白質(zhì)組學相對定量的經(jīng)典方法——穩(wěn)定的同位素標記技術，是向樣品中引入穩(wěn)定同位素標記，通過比較不同同位素標記物的質(zhì)譜信號強度實現(xiàn)不同樣品中蛋白質(zhì)的相對定量分析。樣本在質(zhì)譜分析前、穩(wěn)定同位素標記后混合，一次性實現(xiàn)差異蛋白質(zhì)定量，有效消除了非標記定量分析過程中的不穩(wěn)定性，最大程度減小了定量誤差，主要技術包括通過細胞培養(yǎng)中的氨基酸對同位素進行穩(wěn)定同位素標記（SILAC）、酶促標記法以及化學標記法，化學標記法是蛋白質(zhì)組學研究中最常用的方法之一，因為它提供了將同位素標記選擇性地引入肽或蛋白質(zhì)所需位置的靈活性。它有一個類似于代謝標記的原理，化學反應是用來將這些標記合并到它們想要的位置[22]。一般的外泌體蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析流程如圖1。

3?外泌體蛋白質(zhì)組學在腎臟疾病診療中的應用

腎臟是一個復雜的器官，對體內(nèi)體液平衡起著至關重要的作用，其損傷以及改變對個人的健康產(chǎn)生巨大影響。腎臟的功能單位，即腎單位，在不同的結構（腎小球、小管等）和高度分化的極化上皮細胞方面顯示出精細的組織結構，所有這些細胞都具有特定的轉運特性。因此，編碼不同蛋白質(zhì)的基因突變，如受體、通道和轉運蛋白、酶、轉錄因子和結構成分，不僅影響腎功能，而且影響腎外器官。因此，外泌體蛋白質(zhì)組學在腎臟的形成及相關疾病的診療是具有一定潛力的。

3.1?糖尿病腎病?糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一種進行性腎臟疾病，是糖尿病的主要并發(fā)癥，也是終末期腎臟疾病最常見的病因，以腎病綜合征和彌漫性腎小球硬化為特征。早期DN無明顯的癥狀。目前，在診斷有糖尿病的基礎上，微量白蛋白尿以及大量蛋白尿為評估糖尿病腎病風險的最佳無創(chuàng)性指標，但仍有其局限性。RAIMONDO等人[24]應用無標記LC-MS/MS方法從2型DN動物模型中分離出尿外泌體的差異蛋白質(zhì)組，這些蛋白質(zhì)主要是膜相關或細胞質(zhì)的，參與運輸、信號和細胞黏附，是外泌體蛋白的經(jīng)典功能，提示外泌體蛋白質(zhì)組學在DN生物標志物發(fā)現(xiàn)中的潛力。ZUBIRI等人[25]發(fā)現(xiàn)DN大鼠腎組織中的調(diào)節(jié)蛋白-30明顯下調(diào)，同樣的，在其尿外泌體也有相同的變化趨勢，同時這些結果在人類樣本的初步研究中得到了進一步證實。同樣，ZUBIRI等[26]發(fā)現(xiàn)DN患者尿外泌體中AMBP、MLL3和VDAC1呈現(xiàn)顯著的改變，表明外泌體蛋白質(zhì)組學可以作為DN早期診斷和進展監(jiān)測的新工具。

3.2?高血壓性腎病?蛋白尿是高血壓患者中心血管風險和腎臟損害的指標，慢性腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）抑制可促進血壓控制并防止新發(fā)性白蛋白尿的發(fā)展。然而，盡管存在慢性RAS阻滯，仍有大量患者發(fā)生蛋白尿，并且其生理病理機制尚未得到充分研究。GONZALEZ-CALERO等人[27]對目標患者進行了3年的隨訪，其分類為：a）持續(xù)性白蛋白尿患者;b）發(fā)生新蛋白尿的患者;c）維持蛋白尿的患者，組之間進行外泌體蛋白質(zhì)組學分析，總共鑒定出487種蛋白質(zhì)，其中48種蛋白質(zhì)在對高血壓和/或蛋白尿的反應中顯示出改變的模式，通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)顯著改變的蛋白質(zhì)是免疫應答、補體激活、蛋白水解和代謝過程的主要參與者，主要與硫化合物、脂質(zhì)和多糖的代謝有關。鑒定出的蛋白質(zhì)構成藥物開發(fā)的潛在靶標，并可能有助于確定治療策略，以避開長期治療的高血壓患者的蛋白尿進展。

3.3?腎結石?全球范圍內(nèi)，約80%的腎結石由草酸鈣與磷酸鈣混合而成[28]，SINGHTO等[29]發(fā)現(xiàn)與CaO一水化合物（CaOx monohydrate，COM）一起孵育的巨噬細胞外泌體中，Annexin A2 等26種蛋白質(zhì)的含量發(fā)生了明顯變化，經(jīng)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡分析表明，這些差異的蛋白質(zhì)參與了細胞骨架和肌動蛋白的結合、鈣結合、應激反應、轉錄調(diào)節(jié)、免疫反應以及細胞外基質(zhì)的分解。經(jīng)功能分析得知，經(jīng)COM處理的外泌體增強了腎小管細胞的IL-8產(chǎn)生，激活了中性粒細胞遷移，增加了外泌體膜的脆性，與COM晶體的結合能力增強，隨后增強了通過細胞外基質(zhì)遷移腔室的晶體入侵。這表明巨噬細胞外泌體在對COM晶體的炎癥反應中起重要作用，并且可能參與腎間質(zhì)的晶體侵襲、轉錄調(diào)控、免疫應答和細胞外基質(zhì)分解。因此，這些來自COM處理的巨噬細胞的外泌體誘導的協(xié)同反應極大可能促進腎結石的形成。但仍需進一步的研究，特別是在臨床上證實此假設。

3.4?心腎綜合征?慢性心力衰竭（chronic heart failure，HF）破壞正常的腎功能，并導致進一步促進HF進展的心腎綜合征。MELENOVSKY等人[30]在慢性容量超負荷的雄性大鼠體內(nèi)使用主動脈-腔靜脈瘺管誘發(fā)HF，發(fā)現(xiàn)HF腎臟相對于對照組，有67種蛋白質(zhì)的表達差異約1.5倍，且差異最大的是血管緊張素轉換酶，上調(diào)20倍，高級糖基化產(chǎn)物特異性受體、骨膜素、caveolin-1和其他與內(nèi)皮功能有關的其他蛋白質(zhì)（vWF、cavins1-3、T-kininogen2），促炎性ECM激活（MFAP4、collagen-VI、galectin-3、FHL-1、calponin）和參與腎小球濾過膜完整性的蛋白質(zhì)（CLIC5、ZO-1），這些差異蛋白質(zhì)可以與腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活協(xié)同作用，并且可以作為治療心腎綜合征的標志物以及治療靶標。

3.5?監(jiān)測移植組織的免疫排斥反應?腎臟移植是終末期腎臟疾病的首選和最成功的治療方法，但因為受體及供體免疫表型的因素，需要檢測移植是否成活，腎穿則是監(jiān)測的“金標準”，但反復的侵入性操作，產(chǎn)生較多的并發(fā)癥風險和相對較高的費用。有研究證明腎移植后T細胞參與腎臟同種異體移植的急性排斥過程[31]，PARK團隊[32]研發(fā)了iKEA監(jiān)測平臺——整合的腎臟外泌體測定法，此平臺可檢測T細胞淋巴細胞的尿液外泌體，并成功發(fā)現(xiàn)CD3是檢測T細胞來源尿液外泌體的有效標記。SIGDEL等[33]從移植患者中鑒定出的349種外泌體蛋白中，功能上涉及炎癥和應激反應的11種尿液外泌體蛋白在急性排斥患者的尿液樣本中含量更高，其中3種是尿液外泌體所獨有的。尿液外泌體特異的蛋白質(zhì)改變提供了潛力，并提供了一組獨特的敏感生物標志物來監(jiān)測腎移植急性排斥。

3.6?海綿狀海綿腎病?海綿狀海綿腎?。╩edullary sponge kidney，MSK）是一種罕見且被忽視的腎臟疾病，通常與腎鈣化/腎結石病和腎盂前導管中的囊性異常有關，MSK的診斷準確性目前較低，因為它取決于個人經(jīng)驗，并且診斷需要有創(chuàng)放射線和/或腎毒性造影劑進行醫(yī)學成像。BRUSCHI等人[34]從MSK患者的尿液中分離出外泌體并鑒定其中蛋白質(zhì)含量，確定了由20種高區(qū)分蛋白組成的核心小組，最有特征的是Ficolin 1、甘露聚糖結合凝集素絲氨酸蛋白酶2（MASP2）和補體成分4-結合蛋白β（C4BPB），這些都是凝集素補體途徑的主要調(diào)節(jié)成員，F(xiàn)icolin 1可以與MASP2形成復合物以激活凝集素補體途徑[35]，而在MSK患者中MASP2的下調(diào)伴隨著C4BPB的上調(diào)，C4BPB是一種多聚體蛋白，通過阻止經(jīng)典C3和C5轉化酶的形成來抑制補體級聯(lián)反應的激活[36]。這可能反映了腎臟減輕凝集素補體途徑激活的生理嘗試。這也可以解釋FCN1和MASP2的反調(diào)控。但是，需要更多的研究來證實這種效果。所以，根據(jù)以上外泌體蛋白數(shù)據(jù)首次表明凝集素補體途徑可能參與了與MSK相關的復雜生物機制。

4?展望

目前，隨著疾病的多樣化，傳統(tǒng)的診療手段已滿足不了人們對疾病診療的期望，應運而生的精準醫(yī)學成為熱門的話題，而外泌體蛋白質(zhì)組學代表細胞的特定標記，能最大程度地反映細胞的狀態(tài)，因此成為疾病診療的標志物的候選者，但由于目前外泌體的分離純化以及蛋白質(zhì)組學的分析技術尚未成熟，導致相關研究較少，所以，需要進一步深入研究外泌體蛋白質(zhì)，尤其是腎臟疾病，甚至更多相關疾病的預防、診斷、治療和預后等方面，從而在腎臟疾病的診治上獲得新的思路。

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（收稿日期：2020-06-22?修回日期：2020-07-23）

（編輯：梁明佩）