王琳　曾娜　謝瑋平　蔣月蓮　李政　唐麗珠　隆采丹　吳標(biāo)良

【摘要】?目的?觀察糖尿病患者治療前后血外泌體分泌及效應(yīng)因子miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平變化，探討強(qiáng)化血糖、血壓控制對(duì)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。方法?30例糖尿病足患者分別于強(qiáng)化治療1周前后采血，抽提外泌體，行外泌體鑒定，觀察外泌體分泌情況并測(cè)定miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平。結(jié)果?強(qiáng)化血糖、血壓治療后，糖尿病足患者血外泌體miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平升高（P<0.05）;相關(guān)性分析顯示miR-126-3P水平與空腹血糖（FBG）呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.37，P<0.05）。結(jié)論?強(qiáng)化血糖、血壓控制可升高糖尿病足患者外泌體miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平，可能對(duì)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合具有積極意義。

【關(guān)鍵詞】?血糖;血壓;糖尿病足;外泌體;microRNA

中圖分類號(hào)：R587.2???文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.02.004

【Abstract】?Objective?To observe serum exosomes secretion and the changes of levels of mir-126-3p and mir-125b-1-3p in diabetic patients before and after treatment， and to explore the mechanism of intensive blood glucose and blood pressure control on the wound healing of the diabetic foot ulcers. Methods?Blood collection， exosomes extraction and identification were respectively performed on 30 patients with diabetic foot before and after intensive treatment for 1 week. Exosomes were extracted and identified. And then， the secretion of exosomes was observed and the levels of miR-126-3p and miR-125b-1-3p were measured. Results?After intensive blood glucose and blood pressure treatment， blood exosomes miR-126-3P and miR-125b-1-3p levels in diabetic foot patients increased （P < 0.05）; and correlation analysis showed that miR-126-3P levels were positively correlated with fasting blood glucose （FBG） （r = 0.37， P < 0.05）. Conclusion? Intensive blood sugar and blood pressure control can increase the levels of exosomes miR-126-3P and miR-125b-1-3p in diabetic foot patients， which may have positive significance for the wound healing of diabetic foot ulcers.

【Key words】?blood sugar; blood pressure; diabetic foot; exosomes; microRNA

糖尿病的發(fā)病率逐年升高，包括糖尿病足（diabetic foot，DF）等在內(nèi)的并發(fā)癥相應(yīng)增加[1]。目前尚不清楚糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的愈合機(jī)制。外泌體可被多種細(xì)胞類型釋放在血液和其他體液中，是一種易獲取、性質(zhì)穩(wěn)定且無(wú)創(chuàng)性的代謝性疾病生物標(biāo)志物[2～3]。外泌體中包含的小分子核酸MicroRNAs （miRNAs）是一類廣泛的小型非編碼RNA，主要通過(guò)與信使RNA靶點(diǎn)的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的互補(bǔ)序列相互作用來(lái)抑制基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，在目標(biāo)組織中可調(diào)節(jié)炎性胰腺細(xì)胞、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞再生，并影響胰島素信號(hào)、代謝信號(hào)、細(xì)胞存活周期等[4]，從而影響疾病的發(fā)生與進(jìn)展。目前已有研究表明外泌體miR-126-3P、miR-125b-1-3p在慢性潰瘍創(chuàng)面愈合中具有積極意義[5～6]，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察強(qiáng)化血糖、血壓控制對(duì)miR-126-3P、miR-125b-1-3p的影響，探討強(qiáng)化血糖、血壓控制對(duì)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。

1?對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象?收集自2019年6月～2020年5月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的30例2型糖尿病足（T2DMF）患者作為研究對(duì)象。2型糖尿?。═2DM）的診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)以1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）指南為準(zhǔn)[7];糖尿病足參照“糖尿病足防治國(guó)際指南（2019）”診斷[1]。收集患者一般信息及臨床試驗(yàn)指標(biāo)，采集治療前后血液標(biāo)本供檢測(cè)。

1.2?強(qiáng)化治療方案?強(qiáng)化血糖、血壓控制目標(biāo)：空腹血糖（FBG）4.4～6.1 mmol/L，餐后2小時(shí)血糖（2 h PBG）4.4～8.0 mmol/L;血壓（SBP/DBP）≤130/80 mmHg[8]。

1.3?樣本采集及鑒定?采集治療前后血液標(biāo)本，exoEasy試劑盒提取外泌體、Western Blotting法檢測(cè)外泌體特征蛋白CD9、CD63。用exoEasy試劑盒提取外泌體后將樣本凍存。Western Blotting實(shí)驗(yàn)：將待測(cè)樣品剪碎、研磨，置于離心管中，加入RIPA裂解液（北京索來(lái)寶公司）進(jìn)行充分裂解，提取總蛋白并使用ECL發(fā)光試劑盒（中杉金橋公司）測(cè)定總蛋白濃度。先用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離一定量的蛋白質(zhì)，再注入等體積蛋白上樣，依次經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后置于4℃冰箱中保存一夜，在孵育一抗和二抗以后，用PBST洗滌3次，并曝光顯影;最后用Image J軟件分析圖像計(jì)算蛋白灰度值。

1.4?Real Time PCR技術(shù)檢測(cè)miR-126-3P、miR-125b-1-3p表達(dá)水平?外泌體鑒定完成后提取樣本總RNA，使用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒和miRcute miRNA（SYBR Green）試劑盒（均由天根生物科技有限公司提供）將RNA反向轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。此實(shí)驗(yàn)以U6為內(nèi)參，各樣品微小RNA表達(dá)量用U6表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，最后用熒光定量PCR儀，用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。本實(shí)驗(yàn)中的microRNA加尾法單向引物序列分別為miR-125b-1-3p：5′-ACGGGTTAGGCTCTTGGGA-3′，miR-126-3P：5′-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3′，內(nèi)參U6：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。

1.5?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS 26.0和 GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)可視化處理。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，治療前后數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。正態(tài)分布資料間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2?結(jié)??果2.1?相關(guān)臨床指標(biāo)比較?本次收集的糖尿病足患者年齡在35～70歲之間，男性17例，女性13例，糖尿病足病程為1個(gè)月～1年。強(qiáng)化治療前后的FPG、2 hPBG、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2?血清外泌體鑒定?抽提患者強(qiáng)化治療前后的血清外泌體，通過(guò)Western Blotting法均可檢測(cè)到外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101，表明抽提物質(zhì)為外泌體。見(jiàn)圖1。

2.3?強(qiáng)化治療前后血清外泌體?治療后miR-126-3P、miR-125b-1-3p表達(dá)水平較治療前顯著升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表2、圖2、圖3。

2.4?強(qiáng)化血糖控制前后相關(guān)臨床指標(biāo)與目的microRNAs表達(dá)水平的相關(guān)性分析?將治療前后的FPG、2 hPBG、SBP、DBP和miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示治療后空腹血糖水平與miR-126-3P表達(dá)水平呈弱正相關(guān)關(guān)系（r=0.37，P<0.05）。見(jiàn)圖4、圖5。

3?討??論

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）主要有四大類，其分類按大小、亞細(xì)胞來(lái)源和含量，可分為膜顆粒、微泡、外泌體和凋亡小泡[9]。外泌體是直徑大小在30～100 nm之間的有脂質(zhì)雙分子層膜包裹的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，其功能具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊的作用[10]，因此近年來(lái)也被作為糖尿病診斷的一種新型生物標(biāo)志物[11]。

外泌體攜帶的眾多物質(zhì)中，microRNAs受到廣泛關(guān)注。有研究已證實(shí)一些microRNAs在嚙齒動(dòng)物的糖尿病中可作為特殊的生物標(biāo)志物，例如，miR-24、miR-126、miR-146與糖耐量異常有關(guān);miR-122、miR-210、miR-133與疾病進(jìn)展相關(guān);miR-21-5p與炎癥發(fā)生相關(guān)[12～13]。在眾多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-126-3P、miR-125b-1-3p有抑制炎癥和促進(jìn)血管再生的作用[5，14～15]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化血糖治療后，糖尿病足患者的血清miR-126-3P、miR-125b-1-3p基因表達(dá)量與治療前有顯著差異，且表達(dá)量均升高，觀察到這兩種基因的高表達(dá)促進(jìn)了糖尿病足潰瘍面的愈合，其可能的機(jī)制與表觀遺傳機(jī)制相關(guān)。有研究表明[16]，在糖尿病足這一并發(fā)癥中，高血糖、炎癥因子和氧化應(yīng)激等因素，可以調(diào)節(jié)表觀遺傳機(jī)制，影響靶細(xì)胞中miR-126-3P、miR-125b-1-3p等基因的表達(dá)，從而影響糖尿病足的發(fā)展與預(yù)后。可能參與的信號(hào)通路有細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路，miR-126-3P參與下調(diào)磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞單位2（PIK3R2），并激活PI3K，介導(dǎo)Akt/PKB的磷酸化，促進(jìn)外周血管再生，從而影響糖尿病足創(chuàng)面的愈合和控制疾病進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)空腹血糖水平與miR-126-3P表達(dá)水平呈弱正相關(guān)關(guān)系，有關(guān)研究表明[17]，胰島素受體底物（IRS-1）表達(dá)也可被miR-126-3P抑制，從而減少胰島素的抵抗，有利于機(jī)體調(diào)控血糖代謝水平，這為將miR-126-3P基因作為新型生物標(biāo)志物用于糖尿病代謝治療提供了科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高血糖環(huán)境中miR-125b-1-3p的表達(dá)下調(diào)，糖尿病足患者其微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能隨miR-125b-1-3p的升高而受到保護(hù)。且通過(guò)強(qiáng)化血糖、血壓的控制，miR-125b-1-3p表達(dá)上調(diào)后，炎癥反應(yīng)被抑制，從而促進(jìn)新生血管再生，有利于創(chuàng)面愈合，但其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，強(qiáng)化血糖、血壓控制可上調(diào)miR-126-3P、miR-125b-1-3p基因的表達(dá)，這可能是強(qiáng)化代謝治療促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的原因之一。本實(shí)驗(yàn)受樣本量少的限制、采血間隔周期短及個(gè)體差異大等因素的影響，對(duì)臨床資料與miR-126-3P、miR-125b-1-3p表達(dá)水平關(guān)系作出的結(jié)論有一定限制性。針對(duì)以上不足，還有待在進(jìn)一步的研究中加以改進(jìn)和證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-09-03?修回日期：2020-11-16）

（編輯：王琳葵?梁明佩）