沈方方 祝峰 張大偉 張瑾 滕懿群

隨著人們生活水平的提高，肥胖及其相關(guān)代謝綜合征的發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重威脅人類健康。越來越多的臨床資料及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，母親肥胖和孕期營(yíng)養(yǎng)過剩對(duì)胎兒及全生命周期有著深遠(yuǎn)的影響，是兒童肥胖及成年后慢性代謝疾病高發(fā)的重要原因之一[1-2]，但其機(jī)制尚未清晰。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（suppressor of eytokine signaling 3，SOCS3）是瘦素（Leptin）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)反饋抑制因子，對(duì)調(diào)節(jié)同代的Leptin 抵抗和能量穩(wěn)態(tài)非常重要[3]，被認(rèn)為是代謝性疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)[4]，但SOCS3對(duì)子代成年期代謝性疾病影響的相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建肥胖母鼠模型，觀察其子鼠攝食、體重的變化，成年后下丘腦SOCS3 及Janus 激酶（JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活物（STAT）通路中關(guān)鍵分子的變化，探討母鼠高脂飼料喂養(yǎng)對(duì)子鼠下丘腦SOCS3- JAK/STAT 通路的影響，為預(yù)防肥胖等慢性代謝綜合征的發(fā)生提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 只4 周齡SPF 級(jí)C57BL/6J 雌性小鼠均購自蘇州大學(xué)，喂養(yǎng)、繁殖于嘉興學(xué)院動(dòng)物房。飼養(yǎng)條件為（24±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，12 h/12 h 明暗循環(huán)照明。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定，并已獲得嘉興學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 高脂飼料購自江蘇南通特洛菲公司（批號(hào)：TP23300，規(guī)格：1 000 g/包）；普通飼料購自江蘇南京協(xié)同生物公司（批號(hào)：1010083，規(guī)格：2 000 g/包）；Leptin 檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物公司；SOCS3、Leptin 受體（LEPR）、刺鼠相關(guān)蛋白（AGRP）及阿黑皮素原（POMC）等引物均由中國(guó)通用生物技術(shù)公司合成；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本Takara 公司；磷酸化的JAK2（P-JAK2）、JAK2 抗體均購自美國(guó)Cell Signaling公司；磷酸化的STAT3（P-STAT3）、STAT3 抗體均購自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；SOCS3 抗體購自中國(guó)ABclonal 公司；辣根過氧化物酶（HRP）二抗及微管蛋白（tubulin）抗體均購自中國(guó)Tianjin Sungene Biotech公司。儀器多功能酶標(biāo)儀（SPARK）購自瑞士TECAN 公司；普通PCR 儀購自德國(guó)Eppendorf 公司；Thermo Fisher-QS3 實(shí)時(shí)定量PCR 儀購自美國(guó)Thermo 公司；Bio-Rad 凝膠成像儀購自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和建模 將20 只母鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為肥胖母鼠（obese mother，OM）組及非肥胖母鼠（non-obese mother，NM）組兩組，每組10 只，OM 組以高脂飼料喂養(yǎng)，NM 組以普通飼料喂養(yǎng)，均自由采食、飲水。4 周后OM 組平均體重為（24.16±0.81）g，NM 組為（20.13±0.97）g，OM 組體重高于NM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），達(dá)到建模成功標(biāo)準(zhǔn)[5]。兩組母鼠均分別與全同胞健康雄鼠交配，1 雄2 雌同籠1 周后，取出雌鼠單籠飼養(yǎng)至產(chǎn)子。兩組母鼠在孕期繼續(xù)原飼養(yǎng)方案，哺乳期則均以普通飼料喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每只母鼠所產(chǎn)子鼠隨機(jī)選取1 只組成OM 組子鼠（obese mother-descent，OM-D）及NM 組子鼠（non-obese mother-descent，NM-D），每組10 只，所有子鼠出生4 周后均停止哺乳，采用高脂飼料喂養(yǎng)，自由采食、飲水，飼養(yǎng)至17 周齡。兩組子鼠從4 周后開始每周稱體重及每周一、三、五飼料的消耗量，持續(xù)至17 周末，計(jì)算平均日采食量。兩組母鼠產(chǎn)子后4 周末予麻醉脫頸椎處死。OM-D 及NM-D 組子鼠全部于17 周末予麻醉，取眼球血于4 ℃保存（其中兩組子鼠各8 只測(cè)定其Leptin 水平）；脫頸椎處死后取下丘腦組織（其中兩組子鼠各5 只測(cè)定其mRNA 和蛋白表達(dá)水平），放入液氮速凍后，-80 °C 冰箱保存。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 血清Leptin 水平測(cè)定 采用ELISA 法。取子鼠眼球血1 ml，收集的全血于4 ℃隔夜放置，3 500 r/min，10 min，取上清液。最后分別按照試劑盒說明書，在酶標(biāo)儀上對(duì)血清Leptin 水平進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 SOCS3、LEPR、AGRP 及POMC mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR 法。采用Trizol 從子鼠下丘腦組織中提取總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，并在普通PCR 儀上反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。在Thermo Fisher-QS3 實(shí)時(shí)定量PCR 儀上檢測(cè)SOCS3、LEPR、AGRP 和POMC mRNA 表達(dá)水平。以肌動(dòng)蛋白（β-Actin）作為內(nèi)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)運(yùn)行方案為：變性程序（95 ℃10 min），擴(kuò)增定量程序重復(fù)40 次（95 ℃15 s，60 ℃10 s，72 ℃15 s，單次熒光測(cè)量），熔化曲線程序（60～95 ℃，升溫速率0.1 °C/s，連續(xù)熒光測(cè)量）。使用2-ΔΔCt方法測(cè)定相對(duì)mRNA 的表達(dá)水平。本研究使用的引物序列見表1。

1.4.3 SOCS3、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。采用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定子鼠下丘腦組織中總蛋白濃度，將各樣本的蛋白濃度調(diào)整一致，再與1/4 體積的蛋白上樣緩沖液混合后煮沸，變性；通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜；在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜2 h，稀釋SOCS3、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3 及tubulin 抗體（1∶500）, 于4 ℃過夜孵育；第2 天洗膜，用5%脫脂奶粉稀釋HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000）于搖床上孵育90 min，洗膜后，加發(fā)光液，β-tubulin 作為內(nèi)參，用Bio-Rad 成像系統(tǒng)曝光，目標(biāo)蛋白分別與內(nèi)參灰度值相比為各自蛋白表達(dá)水平。

表1 本研究所用的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用Graph Pad Prism 8 進(jìn)行制圖。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組子鼠體重、采食量比較 兩組子鼠4 周齡時(shí)體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），6、17 周齡時(shí)OM-D 組體重均明顯高于NM-D 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。OM-D 組采食量高于NM-D 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組子鼠體重、采食量比較（g）

2.2 兩組子鼠血清Leptin 水平比較 OM-D 組Leptin水平顯著高于NM-D 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組子鼠血清Leptin 水平比較（mmol/L）

2.3 兩組子鼠SOCS3、LEPR、AGRP 及POMC mRNA 表達(dá)水平比較 OM-D 組SOCS3、AGRP、POMC mRNA 表達(dá)水平與NM-D 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而LEPR mRNA 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表4。

表4 兩組子鼠下丘腦SOCS3、LEPR、AGRP 及POMC mRNA表達(dá)水平比較

2.4 兩組子鼠SOCS3、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)水平比較 進(jìn)一步通過Western blot 法發(fā)現(xiàn)，OM-D 組SOCS3 蛋白表達(dá)水平顯著高于NM-D 組，PJAK2/JAK2 較NM-D 組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；OM-D 組P-STAT3/STAT3 較NM-D 組也有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖1、表5。

3 討論

圖1 兩組子鼠SOCS3、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3 蛋白表達(dá)的電泳圖（SOCS3 為細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3；P-JAK2 為磷酸化的Janus 激酶2；JAK2 為Janus 激酶2；P-STAT3 為磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活物3；STAT3 為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活物3）

表5 兩組子鼠SOCS3 蛋白表達(dá)水平、P-JAK2/JAK2、P-STAT3/STAT3 比較

目前大量研究已證實(shí)，當(dāng)母代進(jìn)行高脂飲食產(chǎn)生肥胖表型時(shí)，其子代同樣會(huì)出現(xiàn)胰島素及Leptin 抵抗[6-9]，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，其機(jī)制可能與某些炎癥因子如IL-1β的活性增強(qiáng)[10]、糖代謝調(diào)節(jié)因子表達(dá)異常[11]等有關(guān)。Yang 等[12]報(bào)道了母鼠肥胖會(huì)導(dǎo)致子代的鋅指蛋白423（Zfp-423）啟動(dòng)子區(qū)域的DNA 甲基化、組蛋白的甲基化水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致Zfp-423 表達(dá)水平升高，誘發(fā)子代肥胖。SOCS3 是參與胰島素及Leptin 抵抗的重要因子，抑制SOCS3 活性及其表達(dá)的藥理策略可能是未來治療肥胖癥的方法之一[13-14]，因此SOCS3 在子代中的作用成為研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，攜帶SOCS3 缺失基因的母鼠所生的或由具有相同突變的母鼠撫養(yǎng)的雄性子鼠，其體重減輕、肥胖改善，并且腦質(zhì)量降低[15]。張旭等[16]認(rèn)為檢測(cè)孕前BMI 和孕期增重對(duì)新生兒代謝特征的指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，孕前或孕期母親營(yíng)養(yǎng)過度會(huì)導(dǎo)致子代淋巴細(xì)胞中SOCS3 mRNA 表達(dá)水平升高，而Leptin 誘導(dǎo)的P-STAT3 mRNAs 表達(dá)水平降低。

下丘腦是哺乳動(dòng)物調(diào)控食欲的基本部位，其內(nèi)存在食欲調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞群，其中弓狀核是中樞與外周循環(huán)食欲因子交換信息的重要通路。弓狀核主要合成下丘腦組織神經(jīng)肽Y（neuropeptide，NPY）、AGRP、POMC 等。其中NPY 及AGRP 為促食欲調(diào)節(jié)因子，而POMC 為抑制食欲因子[17]。本研究結(jié)果中，在相同飼料喂養(yǎng)條件下，高脂飼料喂養(yǎng)母鼠的子鼠較正常飼料喂養(yǎng)母鼠的子鼠，下丘腦的攝食基因發(fā)生明顯變化，促食基因AGRP mRNA表達(dá)水平增加，而抑食基因POMC mRNA 表達(dá)水平下降，這與OM-D 組采食量增加的結(jié)果是相吻合的。說明母代高脂飼料喂養(yǎng)可以影響子代的攝食基因的表達(dá)，從而影響子代的食欲及體重。

AGRP 和POMC 的釋放受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)，其中Leptin 是重要的一個(gè)因子。Leptin 與LEPR 的結(jié)合可激活LEPR，減少食物攝入，同時(shí)增加能量消耗。但是大多數(shù)肥胖者均存在Leptin 抵抗[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)高脂飼料喂養(yǎng)母鼠的子代LEPR mRNA 表達(dá)水平無明顯變化，但其Leptin 水平明顯增加，說明子代存在Leptin 抵抗。

Leptin 發(fā)揮抑制食欲的作用是通過與下丘腦的LEPR 結(jié)合，通過JAK2 和STAT3 的磷酸化，激活JAK/STAT 通路。在肥胖個(gè)體中，SOCS3 是JAK/STAT 通路的負(fù)反饋抑制因子，對(duì)抑制Leptin 信號(hào)起著主要作用[19]。研究表明，下丘腦中SOCS3 mRNA 表達(dá)水平降低，小鼠空腹胰島素及葡萄糖水平較低[20]。

本研究證實(shí)，子鼠在相同飼料喂養(yǎng)條件下，17 周末時(shí)OM-D 組較NM-D 組下丘腦中SOCS3 mRNA 表達(dá)水平明顯增加；進(jìn)一步通過Western blot 分析發(fā)現(xiàn)，OMD 組下丘腦中SOCS3 蛋白表達(dá)水平增加，STAT3 蛋白表達(dá)水平明顯減少，且P-STAT3 蛋白表達(dá)水平和PJAK2 蛋白表達(dá)水平也明顯降低。從而推斷，母鼠營(yíng)養(yǎng)過剩會(huì)導(dǎo)致子代成年期下丘腦SOCS3 蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)而抑制了JAK/STAT 信號(hào)通路，產(chǎn)生Leptin 抵抗，導(dǎo)致子鼠促食基因AGRP mRNA 表達(dá)水平增加，而抑食基因POMC mRNA 表達(dá)水平下降，采食量增加，進(jìn)而成年期發(fā)生肥胖等慢性代謝性疾病。

綜上所述，通過構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)過剩的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)子鼠成年期下丘腦中SOCS3 蛋白表達(dá)水平增加，抑制了Leptin-JAK/STAT 信號(hào)通路，下丘腦中的抑食激素POMC mRNA 表達(dá)水平降低，促食激素AGRP mRNA 表達(dá)水平增加，從而導(dǎo)致子鼠采食量增加及成年期肥胖的發(fā)生，這可能是母代營(yíng)養(yǎng)過剩導(dǎo)致子代發(fā)生肥胖的機(jī)制之一。成年期的肥胖、糖尿病等慢性代謝性疾病病因復(fù)雜，如何早期干預(yù)一直備受關(guān)注。本研究對(duì)孕母高脂飲食、子代肥胖和SOCS3 三者之間的關(guān)系進(jìn)行了探討，為預(yù)防孕母肥胖、胎兒營(yíng)養(yǎng)過剩和慢性代謝疾病的發(fā)生提供了理論依據(jù)和方向。