孫雯雯 吳開祥 李小龍 張 亞 東野圣伊 黃 虎 丁寶琪 楊洪川 王新立

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，山東 泰安 271000

免疫組化檢測(cè)技術(shù)在臨床病理診斷工作中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。免疫組化染色技術(shù)因其步驟復(fù)雜，影響因素較多，在免疫組化染色過程中設(shè)立對(duì)照成為免疫組化染色質(zhì)控的重要措施[1-4]。隨著免疫組化技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫組化對(duì)照的設(shè)立涌現(xiàn)出不同的方法。很多方法步驟繁瑣，需要特殊儀器設(shè)備支持，實(shí)用性不高。本科室根據(jù)實(shí)際臨床工作經(jīng)驗(yàn)，在遵循國(guó)際特殊專家委員會(huì)建議及免疫組織化學(xué)檢測(cè)技術(shù)共識(shí)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了免疫組化組織微陣列對(duì)照體系，并用簡(jiǎn)易方法制作蠟塊及切片，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床病理外檢中滿足臨床病理診斷后剩余的常規(guī)新鮮組織。

1.2 儀器設(shè)備

Leica ASP 300自動(dòng)脫水機(jī)、Leica RM2235石蠟切片機(jī)、Leica 819一次性病理刀片、Leica EG1150H石蠟包埋機(jī)及冷臺(tái)、不銹鋼包埋模具、世泰粘附性載玻片。

1.3 組織微陣列體系的構(gòu)建

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室抗體使用頻率、所需對(duì)照組織獲取的難易度、抗體在不同組織中表達(dá)情況，遵循國(guó)際特設(shè)專家委員會(huì)推薦18種常見抗體對(duì)照組織、免疫組織化學(xué)檢測(cè)技術(shù)共識(shí)及染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建組織微陣列體系，滿足每種抗體在檢測(cè)時(shí)具有至少一個(gè)的陽性對(duì)照，一個(gè)陰性對(duì)照，并盡可能提供多個(gè)陽性、陰性對(duì)照組織。

1.4 目的組織篩選

所需組織用10%中性緩沖福爾馬林固定24～48 h，按常規(guī)取材標(biāo)準(zhǔn)取材，全自動(dòng)脫水機(jī)常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，包埋成蠟塊。將蠟塊行HE切片并染色，根據(jù)鏡下觀察選定組織的目的區(qū)域，并作標(biāo)記。目的區(qū)域的選擇應(yīng)首先滿足無鈣化無壞死無異物(如縫合用鋼釘)區(qū)，其次要保證抗體表達(dá)的陽性部位存在，如闌尾要有淋巴濾泡及腺體結(jié)構(gòu)，甲狀腺要有正常腺體，結(jié)腸、胃等要保證有腸粘膜、胃粘膜，所選腫瘤組織如乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等鏡下確保是腫瘤組織。

1.5 組織微陣列蠟塊的制作

用廢舊一次性病理刀片，將組織目的區(qū)域切成約0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm的小組織塊，按照組織微陣列對(duì)照體系分組，用尺寸較小的包埋磨具(約0.7 cm×0.7 cm)將目的組織包埋，制成組織微陣列蠟塊并標(biāo)記編號(hào)。包埋時(shí)要注意組織方向，如闌尾、結(jié)腸、食管等管腔類組織縱切面朝下，并確保全部組織埋平。

1.6 組織微陣列切片的制作

組織微陣列蠟塊冷凍后進(jìn)行切片，切片厚度2.0～2.5 μm，蠟片貼裱于免疫組化專用粘附性載玻片據(jù)底端0.5 cm處中央，用鉛筆標(biāo)記陽性對(duì)照組織微陣列的編號(hào)，72 ℃烤片15～30 min，或室溫自然涼片至干燥。室溫保存?zhèn)溆?，隨切隨用，對(duì)照片滿足1周使用即可，防止時(shí)間過長(zhǎng)引起抗原丟失。組織微陣列蠟塊每次切完后放置于-20 ℃冰箱內(nèi)冷藏，隨用隨切，還可保護(hù)組織內(nèi)抗原，防止其丟失。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建了5個(gè)組織微陣列對(duì)照體系，編號(hào)為1～5。1號(hào)包括闌尾、肺、肝癌、胰腺、扁桃體；2號(hào)包括子宮內(nèi)膜及肌層、乳腺癌、宮頸癌、食管、結(jié)腸；3號(hào)包括網(wǎng)膜、甲狀腺、胎盤、腎、胃；4號(hào)包括GIST、腱鞘巨、前列腺癌、P53、睪丸；5號(hào)包括表達(dá)(0，1+，2+，3+)her-2的乳腺癌組織。5個(gè)組織微陣列，分別用于不同抗體的對(duì)照使用，可為我科室130多種抗體提供穩(wěn)定可靠的陽、陰性組織對(duì)照。具體見表1。

表1 組織微陣列對(duì)照體系構(gòu)成

2.2 制作了5種組織微陣列蠟塊，無需特殊儀器設(shè)備，技術(shù)易掌握(圖1)。

2.3 制作了5種組織微陣列切片，方法簡(jiǎn)單，組織貼裱于載玻片據(jù)底端0.5 cm處中央，被測(cè)試組織貼裱其上方即可，整齊美觀(圖1)。

a：組織微陣列蠟塊；b:檢測(cè)組織與微陣列對(duì)照組織染色切片；c:組織微陣列免疫組化染色后鏡下表現(xiàn)。

3 討 論

免疫組化染色步驟繁多，任何一步操作不當(dāng)都可能會(huì)影響染色結(jié)果，進(jìn)而影響病理診斷的準(zhǔn)確性。在免疫組化染色過程中設(shè)立對(duì)照是進(jìn)行染色質(zhì)量控制的重要措施之一，通過陽性對(duì)照、陰性對(duì)照的染色結(jié)果可驗(yàn)證免疫組化操作步驟是否正確、染色結(jié)果是否準(zhǔn)確及染色試劑是否有效，從而確保免疫組化染色技術(shù)最佳化和結(jié)果的有效性。理想狀況的對(duì)照是將一個(gè)已知的抗原表達(dá)情況的組織和待檢測(cè)樣本置于同一張切片上進(jìn)行染色，確保所有試劑同時(shí)與待檢測(cè)樣本和對(duì)照組織反應(yīng)，最大限度地保證二者檢測(cè)條件的一致性[5-8]。免疫組化染色結(jié)果的判讀包括兩個(gè)方面，即定性分析和定量分析，因此設(shè)置的陽性對(duì)照不僅要滿足驗(yàn)證目的抗原的存在與否，而且不同的陽性對(duì)照組織要反應(yīng)出抗原表達(dá)水平的弱強(qiáng)。設(shè)置陽性對(duì)照還應(yīng)該遵循適用免疫組化染色的檢測(cè)下限(lowlimitofdetection，LLOD)原則，即在已知的低表達(dá)某一抗原蛋白的組織或細(xì)胞成分中能觀察到陽性反應(yīng)[9-10]。

單一組織做陽性對(duì)照，不僅不能滿足免疫組化陽性、陰性對(duì)照等上述要求，而且實(shí)際工作中三甲醫(yī)院病理科應(yīng)用抗體數(shù)量一般達(dá)百余種，每種抗體設(shè)立陽性對(duì)照，需要的陽性對(duì)照蠟塊必定很多，切好備用的對(duì)照片種類及數(shù)量相應(yīng)更多，實(shí)際應(yīng)用中易造成工作程序復(fù)雜，桌面混亂不整潔，對(duì)照片使用錯(cuò)誤等情況。因此利用組織微陣列做免疫組化染色對(duì)照成為免疫組化質(zhì)量控制的利器。本組織微陣列體系的構(gòu)建是根據(jù)實(shí)際臨床工作經(jīng)驗(yàn)，在遵循國(guó)際特殊專家委員會(huì)建議、免疫組織化學(xué)檢測(cè)技術(shù)共識(shí)的基礎(chǔ)上，由多年免疫組化操作經(jīng)驗(yàn)技師與具有免疫組化診斷經(jīng)驗(yàn)的高年資病理診斷醫(yī)師共同構(gòu)建的，5個(gè)組織微陣列可滿足我科室130多種抗體的免疫組化染色中對(duì)照使用。1號(hào)組織微陣列覆蓋的抗體范圍達(dá)60余種，主要用于標(biāo)記淋巴瘤，肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的鑒別診斷抗體；2號(hào)組織微陣列為診斷上皮來源腫瘤、乳腺癌、宮頸癌的抗體對(duì)照；3號(hào)組織微陣列提供了來源間皮、甲狀腺、腎臟、胎盤、胃等部位的抗體對(duì)照；4號(hào)組織微陣列提供了腱鞘巨細(xì)胞腫瘤、間質(zhì)瘤、前列腺及睪丸腫瘤的鑒別診斷抗體對(duì)照；5號(hào)微陣列專門針對(duì)乳腺癌、胃癌等染Her-2提供對(duì)照[11-12]。組織微陣列構(gòu)成可根據(jù)科室自身情況靈活調(diào)整，尤其是科內(nèi)罕見病的特殊對(duì)照，如：標(biāo)記惡性黑色素瘤melanA，標(biāo)記基因異位型腎細(xì)胞癌的TFE-3等需要專門留取。

傳統(tǒng)組織微陣列蠟塊的制作需要組織芯片儀等儀器設(shè)備，過程繁瑣，對(duì)技師技能和石蠟品質(zhì)要求較高，因打孔位置不準(zhǔn)確、凝蠟程度把握不到位等，易出現(xiàn)石蠟碎裂、組織塌陷或切片時(shí)組織蹦飛等情況[13-14]，實(shí)際操作困難。本組織微陣列蠟塊制作方法優(yōu)點(diǎn)頗多：技術(shù)方面，操作簡(jiǎn)單，無需制備空白蠟塊、無需打孔、定位、注芯等精確度高、難度系數(shù)較大的操作，每個(gè)微陣列組織數(shù)量約4～5個(gè)，所需組織來源廣泛，包埋時(shí)保證埋平即可，不額外增加制作難度；病理診斷安全方面，選取的對(duì)照組織是滿足臨床病理診斷需求剩余的組織，而不是在原病理診斷的蠟塊上鉆取組織，不僅保護(hù)了病理診斷的原始蠟塊，還使得病理標(biāo)本發(fā)揮更多有益作用；在經(jīng)濟(jì)方面，利用廢舊的一次性病理刀片切割組織，不需要購(gòu)買組織芯片儀、組織芯片穿刺針等儀器設(shè)備，也無需購(gòu)置價(jià)格昂貴的高純度切片石蠟，不增加科室額外支出。

該組織微陣列總面積約0.5 cm×0.5 cm，占用玻片面積小，不妨礙待測(cè)試組織裱貼，適用于手工染色及自動(dòng)染色機(jī)染色。組織微陣列貼裱于載玻片距底端0.5 cm處，不會(huì)造成因測(cè)試組織位置過高而引起的試劑浪費(fèi)，如leica bond max自動(dòng)染色機(jī)，還可防止其covertile邊框把玻片邊緣的組織抹掉，保證了對(duì)照組織在染色過程中的完整性。被測(cè)試組織均位于對(duì)照微陣列的同一個(gè)方向，可方便診斷醫(yī)師閱片，且整齊美觀。

簡(jiǎn)言之，本組織微陣列對(duì)照方法科學(xué)合理，既保留了組織微陣列體積小、通量高、靈活性強(qiáng)、檢測(cè)試劑與實(shí)驗(yàn)條件一致性、實(shí)驗(yàn)誤差小等優(yōu)點(diǎn)[15-16]，還具備經(jīng)濟(jì)節(jié)約、操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)。不僅滿足免疫組化染色質(zhì)控要求，而且操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，大大提高工作效率，符合免疫組化染色標(biāo)準(zhǔn)，值得在實(shí)際臨床免疫組化染色工作中推廣。