燕 妮,孫世琨

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730300）

隨著人民生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)肉及肉制品的需求逐年增加，普通的產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足廣大消費(fèi)者的需求，此時(shí)一些優(yōu)質(zhì)高蛋白的肉類產(chǎn)品、加工肉制品脫穎而出，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、種類多、食用方便而深受廣大消費(fèi)者喜愛。肉及肉制品可以提供人類維持生命活動(dòng)所必需的氨基酸、多種維生素（如維生素B6、B12、維生素D 等）、多種微量元素（鐵、鋅和硒等）以及大量的不飽和脂肪酸[1]。在利益的驅(qū)使下，一些不法商家為了牟利將低價(jià)肉（雞、鴨等）摻入或冒充高價(jià)肉（牛、羊等），市場(chǎng)上肉類摻假現(xiàn)象屢禁不止[2]。目前已經(jīng)研發(fā)了多種檢測(cè)方法來(lái)鑒別肉類摻假現(xiàn)象，其準(zhǔn)確性和高效性逐漸提升，但仍有欠缺，如無(wú)法高通量快速檢測(cè)等問題。

肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的鑒定方法很多，如近紅外光譜法、酶聯(lián)免疫法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。自PCR 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的測(cè)定以來(lái)，基于DNA 的PCR 分析技術(shù)也在不斷發(fā)展，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、AFLP (擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)標(biāo)記法、PCR-RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)、基因芯片技術(shù)和DNA 條形碼技術(shù)等。本文綜合論述了目前肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)有應(yīng)用前景的新技術(shù)做了簡(jiǎn)要闡述。

1 理化檢測(cè)方法

理化檢測(cè)方法主要是利用樣品的光學(xué)特性、化學(xué)組成等特點(diǎn)檢測(cè)不同動(dòng)物品種的肉類組分。常見的方法有近紅外光譜法、高效液相色譜 法等。

1.1 近紅外光譜法

近紅外光譜法主要利用樣品的光學(xué)特性，通過光在樣品中吸收、反射、散射等特點(diǎn)構(gòu)建待測(cè)樣品的特征光譜進(jìn)而區(qū)分樣品種類，是一種快速有效的檢測(cè)方法[3]。趙紅波等以近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合模式判別方法，建立了一種準(zhǔn)確、快速鑒別豬肉和牛肉的方法[4]。周嬌嬌等利用近紅外光譜分技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立了SVM 模型，可以快速鑒別7 種淡水魚品種[5]。白京等應(yīng)用近紅外漫反射光譜分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)羊肉卷中豬肉摻假比例的定量檢測(cè)研究，將不同樣品的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行建模分析，實(shí)現(xiàn)了羊肉卷中豬肉摻假比例的定量檢測(cè)[6]。近紅外光譜法操作簡(jiǎn)單，快捷、樣品用量少且無(wú)損樣品等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功地應(yīng)用在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

1.2 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是通過高分辨質(zhì)譜技術(shù)尋找不同物種的特異性多肽，再利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性及定量，該技術(shù)因靈敏度高、樣品前處理簡(jiǎn)單、可以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性樣品、可同時(shí)測(cè)定多個(gè)物種而廣泛應(yīng)用在食品檢測(cè)中。

Kim 等凝膠電泳結(jié)合高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，尋找四種主要肉類物種的區(qū)別標(biāo)記。利用一維凝膠電泳法分別對(duì)各類肉質(zhì)的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白進(jìn)行分析，然后通過高效液相質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析，證實(shí)可以利用肌鈣蛋白（TnI）、烯醇化酶、乳酸脫氫酶（LDH）和三磷酸異構(gòu)酶（TPI）的電泳遷移率不同，可作為不同肉制品區(qū)分的標(biāo)志[7]。Magdalena Montowska等利用雙向電泳技術(shù)對(duì)目標(biāo)的六種動(dòng)物的一部分蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一類蛋白質(zhì)在肉類老化變質(zhì)和加工完成的過程中含量相對(duì)穩(wěn)定，然后通過質(zhì)譜對(duì)這類蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析。研究發(fā)現(xiàn)以調(diào)節(jié)蛋白、代謝酶、一些肌原纖維蛋白和血漿蛋白的特定物種的電泳遷移率差異為特征，可以區(qū)分肉質(zhì)的種類[8]。電泳和質(zhì)譜結(jié)合被廣泛運(yùn)用于鑒別領(lǐng)域，但是存在無(wú)法進(jìn)行高通量分析的缺點(diǎn)。

Sarah 等采用LC-QTOF-MS 方法對(duì)冷凍、蒸煮豬肉的胰蛋白酶進(jìn)行標(biāo)記，建立MRM 方法進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）能檢測(cè)到四種肽，這四種肽在豬肉樣本中始終存在，可以作為從熱加工肉品中鑒定區(qū)分出豬肉與牛肉和其他肉類的被標(biāo)記物[9]。這研究體現(xiàn)了蛋白組學(xué)方法的特異性和選擇性的優(yōu)點(diǎn)。古淑青等采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（HPLC-QE）和超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）相結(jié)合的方法進(jìn)行特征肽段的檢測(cè)，再通過比對(duì)分析篩選出4 種肉類的20 個(gè)特征性多肽段，進(jìn)行驗(yàn)證和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）定量研究，建立了羊肉摻假鑒別的定量測(cè)定方法[10]。張穎穎等首先采用高分辨質(zhì)譜儀（nLC-QE）分別找出牛肉、豬肉和雞肉的相對(duì)專屬性多肽鏈，進(jìn)一步利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)摻雜豬肉或雞肉的牛肉進(jìn)行檢測(cè)，可以快速進(jìn)行鑒別并準(zhǔn)確定量分析[11]。李瑩瑩等利用蛋白組學(xué)的方法研究了5 種常見的食用肉中相對(duì)種屬特征性多肽，采用LC-MS/MS 技術(shù)對(duì)羊肉和鴨肉混合物種特征性的多肽進(jìn)行了驗(yàn)證和定量分析，可準(zhǔn)確的區(qū)分不同的肉種類[12]。Sentandreu 等通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)樣品物種特異性肽段或氨基酸，建立了一種檢測(cè)肉制品中是否摻入雞肉成分的方法[13]。金紹明等應(yīng)用非標(biāo)記蛋白準(zhǔn)確定量的方法，通過四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜分析每種肉類樣品的特異性肽段，進(jìn)而準(zhǔn)確分析摻假肉類的種類[14]。色譜和質(zhì)譜是基于動(dòng)物肌肉蛋白的特征性肽段來(lái)鑒別肉類品種的，而蛋白質(zhì)在加工過程中容易發(fā)生變性從而增加檢測(cè)難度。

2 以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

常見的以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法有基于抗原-抗體特異性識(shí)別的酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法等方法，具有快速、簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高和低成本的特性。肉類摻假常見的檢測(cè)方法是ELISA 技術(shù)的間接法和雙抗體夾心法，其原理是通過對(duì)樣品中的特異性抗原進(jìn)行定性或定量識(shí)別從而鑒別不同物種的肉類[15-16]。

Liu 等建立了以單克隆抗體為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，該方法使用一對(duì)可以特異性識(shí)別骨骼肌肌鈣蛋白I (TnI)的單克隆抗體(MAbs 8F10 和5H9)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，可以測(cè)定生鮮肉、加工肉以及飼料中豬肉成分的含量，為檢測(cè)肉制品和飼料制品中微量豬肌肉組織的污染提供了一種快速、可靠的方法，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量和安全[17]。Rittenbur 等建立了一種間接酶聯(lián)免疫吸附法，該方法可以快速、靈敏地測(cè)定肉制品中大豆蛋白的含量[18]。免疫技術(shù)操作簡(jiǎn)便、靈敏性高，但對(duì)沒有特異性抗體的樣品不能進(jìn)行分析，且品種接近的蛋白之間可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，掩蓋品種特異性的條帶，因此可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[19]。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

與基于蛋白質(zhì)的方法相比，基于DNA 的檢測(cè)方法通常被認(rèn)為更靈敏、可靠，因?yàn)镈NA 在高溫下相對(duì)穩(wěn)定，并且存在于大多數(shù)細(xì)胞中，而大多數(shù)蛋白質(zhì)在加工過程中失去了它們的生物活性[20-21]。近年來(lái)，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢驗(yàn)方法高速發(fā)展起來(lái)，各種動(dòng)物源性成分的檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)相繼涌現(xiàn)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)、多重PCR 技術(shù)、核酸印跡法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基于分子雜交的基因芯片技術(shù)、微滴數(shù)字PCR 方法和DNA條形碼技術(shù)[22]。

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)

現(xiàn)行的動(dòng)物源性成分檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中，較為多見的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，該技術(shù)在擴(kuò)增體系中引入熒光集團(tuán)，通過熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，該方法與傳統(tǒng)PCR 方法相比更加靈敏、準(zhǔn)確以及便捷[24]。趙新等以線粒體中細(xì)胞色素b 的DNA 序列為目的基因，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、反應(yīng)方法優(yōu)化等建立了肉制品中羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別方法[25]。Xu 等建立了一種多重TaqMan 實(shí)時(shí)核酸聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)鴨肉、豬肉、牛肉和雞肉四種源性成分[26]。

3.2 微滴數(shù)字PCR 技術(shù)

微滴數(shù)字PCR 技術(shù)是一種新興的核酸定量檢測(cè)方法，通過微滴生成儀把反應(yīng)體系均分到大量反應(yīng)單元中獨(dú)立地進(jìn)行PCR，并根據(jù)泊松分布和陽(yáng)性比例來(lái)計(jì)算DNA 初始濃度，與傳統(tǒng)PCR、定量PCR相比，其結(jié)果的精確度、準(zhǔn)確性和靈敏度更佳[27]。

李偉琦等建立了一種適用于微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)和芯片式數(shù)字PCR(cdPCR)平臺(tái)的火雞成分定性定量檢測(cè)方法，探索了火雞肉質(zhì)量與DNA 濃度、DNA 濃度與拷貝數(shù)濃度之間的關(guān)系，且分別確定了ddPCR 與cdPCR 平臺(tái)的檢測(cè)限[28]。史艷宇等建立了一種肉制品中鴨源性成分的微滴數(shù)字PCR 檢測(cè)方法，可以有效測(cè)定鴨源性成分且抗干擾性強(qiáng)，靈敏度高[29]。Cai 等以微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)生肉重量與DNA 重量、DNA 重量與DNA拷貝數(shù)都呈線性關(guān)系，建立了基于DNA 拷貝數(shù)計(jì)算生肉重量的公式，從而對(duì)肉制品中豬肉和雞肉進(jìn)行準(zhǔn)確定量[30]。王珊等通過微滴式數(shù)字PCR 方法對(duì)樣品中的羊源性和豬源性成分的含量比例進(jìn)行了準(zhǔn)確定量，該方法對(duì)判斷樣品中其他種類的動(dòng)物源性成分是故意添加還是無(wú)意沾染提供了技術(shù)支持[31]。Wang 等應(yīng)用微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)建立了肉制品中山羊和綿羊的檢測(cè)方法，并確定了檢出限和定量限分別為1 和5 copies/μL，通過用已知比例的混合樣品和市售產(chǎn)品驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明ddPCR 方法在山羊和綿羊源性定性及定量檢測(cè)方面具有較高的精確性和實(shí)用性[32]。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)能對(duì)模板濃度進(jìn)行精準(zhǔn)定量，但其成本較高，難以大面積推廣應(yīng)用。

3.3 基因條形碼技術(shù)

基因條形碼技術(shù)指用某物種特異性的小片段DNA 序列來(lái)代表該物種，就像超市利用條形碼掃描區(qū)分不同的商品一樣，通過分析這段DNA 序列從而實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化的物種鑒別。因動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基基因具有物種特異性的單核苷酸位點(diǎn)，且在深加工的肉制品中保存較為完整，故通常選擇其作為條形碼基因。邱德義等提取了16 份魚類及其制品的基因組DNA，利用動(dòng)物細(xì)胞色素C 氧化酶I（COI）基因的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，通過Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)、DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì)分析鑒定，快速鑒別魚肉等水產(chǎn)制品的動(dòng)物源性成分[33]。李新光運(yùn)用DNA 條形碼技術(shù)、PCR-RFLP 和熒光定量PCR 等技術(shù)建立了常見魚類成分鑒別技術(shù)體系，為魚肉及其制品的真?zhèn)舞b別提供技術(shù)支持[34]。王爽等以牛、羊、豬、鴨4 種動(dòng)物的基因組DNA 為模板，以COI 基因?yàn)榘谢蛐蛄?，通過13 對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序從中篩選出最優(yōu)序列，從而建立了4 種動(dòng)物源性食品的DNA 條形碼鑒別技術(shù)[35]。Hellberg等通過對(duì)60 種肉類和家禽產(chǎn)品的細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I(COI)基因進(jìn)行全長(zhǎng)條形碼(658bp)和迷你條形碼(127bp)編碼，將得到的序列與生物條碼數(shù)據(jù)庫(kù)(BOLD)和基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全條形碼的測(cè)序成功率(68.3%) 高于微型條形碼的測(cè)序成功率(38.3%)，為深加工肉類產(chǎn)品的動(dòng)物源性檢測(cè)提供技術(shù)參考[36]。雖然DNA 條形碼技術(shù)操作簡(jiǎn)單，但也存在一定的局限性，如DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)亟待完善、不太適用于多組分肉類制品的檢測(cè)等。

近年來(lái)，肉類摻假事件屢有報(bào)道，相應(yīng)的可追溯性問題越來(lái)越受到重視，因此，開發(fā)高效、快速、低成本的檢測(cè)方法來(lái)識(shí)別肉類樣品中的動(dòng)物源性成分來(lái)源迫在眉睫。