劉 杰， 張雄杰， 霍秉新， 尹 春， 劉 燕， 賈長松， 盛晉華

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古天際綠洲特色生物資源研發(fā)中心， 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古天衡制藥有限公司， 內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 014400)

蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao]為豆科蝶形花亞科黃耆屬多年生草本[1-2]，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[3-4]，是內(nèi)蒙古的道地藥材[5]，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪含有鋅、鐵、硒、銅等多種微量元素以及多糖類、三萜皂苷、黃酮類等多種化學(xué)成分[6-7]，具有保護(hù)心肌缺血及神經(jīng)損傷、抗氧化、抗病毒等功效[8]，在中藥預(yù)防新型冠狀病毒肺炎方案中，黃芪是出現(xiàn)頻次最高的中藥之一[9]。目前隨著蒙古黃芪市場需求的加大以及野生資源的減少，人工栽培的面積逐漸加大，但由于蒙古黃芪種子硬實(shí)性高、發(fā)芽率低，制約其規(guī)范化生產(chǎn)[10]。前人對提高蒙古黃芪種子發(fā)芽率的處理方式有了一定的研究，許陶瑜等[11]結(jié)果表明，全光照和全黑暗條件對蒙古黃芪種子萌發(fā)的影響均不顯著；赤霉素和雙氧水處理雖然也可以提高黃芪硬實(shí)種子的發(fā)芽率但效果不明顯[12]；低濃度的聚乙二醇(PEG)和NaCl對蒙古黃芪種子的萌發(fā)也無促進(jìn)作用[13]；而磨砂[14]、溫水和75%酒精浸種[15]、98%濃硫酸浸泡[16]等處理均能有效破除蒙古黃芪種子硬實(shí)性，提高蒙古黃芪種子的發(fā)芽率，但對于磨砂時間、浸種溫度、浸種時間梯度的研究較少，且研究較多的是甘肅蘭州[17]、山西大同[18]、內(nèi)蒙古赤峰[19]等地區(qū)的蒙古黃芪種子，對于蒙古黃芪道地產(chǎn)區(qū)內(nèi)蒙古武川地區(qū)的種子研究較少。

本研究以內(nèi)蒙古武川縣的種子為材料，綜合考慮成本及危險性等方面，本試驗(yàn)選用磨砂+溫水浸種的方式，將蒙古黃芪種子發(fā)芽率作為評價指標(biāo)，以磨砂時間、浸種溫度、浸種時間為考察因素，采用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，優(yōu)化蒙古黃芪種子的處理方式，進(jìn)而提高其發(fā)芽率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

種子取自2019年內(nèi)蒙古武川縣和太仆寺旗蒙古黃芪基地留種田，千粒重為(5.86±0.14)g，凈度為(92.81±2.14)%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用常規(guī)的培養(yǎng)皿發(fā)芽法，取籽粒飽滿且有光澤的蒙古黃芪種子經(jīng)10%次氯酸鈉表面消毒后，用蒸餾水沖洗干凈，磨砂(砂紙打磨)后放入溫水中浸泡，并均勻排列在墊有兩層濾紙的90 mm玻璃培養(yǎng)皿中，放置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，發(fā)芽期間每天定時補(bǔ)充蒸餾水保持濾紙濕潤，觀察種子萌發(fā)情況并記錄。

以磨砂時間5 min、浸種溫度40 ℃、浸種時間5 min為基礎(chǔ)分別設(shè)3個單因素試驗(yàn)，其中磨砂時間設(shè)5、10、15、20 min四個處理；浸種溫度設(shè)40、50、60、70、80 ℃五個處理；浸種時間設(shè)5、10、15、20、25 min五個處理。每個處理100粒種子，重復(fù)3次。根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，以磨砂時間、浸種溫度、浸種時間為自變量，發(fā)芽率為響應(yīng)值，并根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果篩選確定因素水平，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

自吸水后，每24 h觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)量，以種子胚根突破皮≥2 mm為種子發(fā)芽，截至第7天計(jì)算發(fā)芽率。計(jì)算公式為：

發(fā)芽率(%)=(n/N)×100%，式中：n為最終正常發(fā)芽的粒數(shù)；N為供試種子總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用WPS軟件整理，用SPSS 25、Design-Exper 8.06等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

由圖1可知，隨著磨砂時間的增加，蒙古黃芪種子的發(fā)芽率呈先增高后降低的趨勢。以磨砂時間15 min發(fā)芽率最高，達(dá)到72%，確定適宜的磨砂時間是10～20 min。

由圖2可知，隨著浸種溫度的增加，蒙古黃芪種子的發(fā)芽率呈先增高后降低的趨勢。以浸種溫度60 ℃發(fā)芽率最高，達(dá)到76%，確定適宜的浸種溫度是50～70 ℃。

由圖3可知，隨著浸種時間的增加，蒙古黃芪種子的發(fā)芽率呈先增高后降低的趨勢。以浸種時間10 min發(fā)芽率最高，達(dá)到77%，確定適宜的浸種時間5～15 min。

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的因素水平(見表1)做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，以發(fā)芽率為響應(yīng)值，通過二階多項(xiàng)式進(jìn)行回歸，所建模型的方差分析見表3，得實(shí)際因素的回歸方程為Y=-216.970 00+8.909 50 A+8.753 25 B+1.253 00 C+0.056 500 AB+0.020 000 AC+0.040 000 BC-0.453 90 A2-0.088 475 B2-0.220 90 C2。由表3可知，模型達(dá)到極顯著水平(p<0.01)，模型決定系數(shù)R2=0.994 1，說明模型擬合程度好，失擬項(xiàng)未達(dá)到顯著水平(p>0.05)，表明誤差較小。其中，A、B、C、AB、A2、B2、C2均達(dá)到極顯著水平(p<0.01)；BC達(dá)到顯著水平(p<0.05)；AC未達(dá)到顯著水平(p>0.05)。

表1 因素與水平Table 1 Settings of factors and levels

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design scheme and results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis results of regression model

根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，應(yīng)用Design-Exper 8.06軟件繪制三維響應(yīng)曲面，見圖4～圖6。

由圖4～圖6可以直觀地看出各因素交互作用對蒙古黃芪種子發(fā)芽率的影響，曲線密集或陡峭程度越高則表明對結(jié)果響應(yīng)值影響越大[20]。由圖4可知，沿著浸種溫度方向等高線比磨砂時間等高線更加密集陡峭，浸種溫度對蒙古黃芪種子發(fā)芽率的影響要大于磨砂時間；由圖5可知，沿著磨砂時間等高線比浸種時間等高線更加密集陡峭，磨砂時間對蒙古黃芪種子發(fā)芽率的影響要大于浸種時間；由圖6可知，沿著浸種溫度等高線比浸種時間等高線更加密集陡峭，浸種溫度對蒙古黃芪種子發(fā)芽率的影響要大于浸種時間。由圖4～圖6得各因素對蒙古黃芪種子發(fā)芽率影響的大小為：浸種溫度>磨砂時間>浸種時間。

由回歸模型進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)芽率的預(yù)測值為92%，最佳處理方式為磨砂時間13 min、浸種溫度56 ℃、浸種時間8 min。在該處理方式下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，得出蒙古黃芪種子的實(shí)際發(fā)芽率為(90.7±1.5)%，與理論預(yù)測值基本吻合，比單因素試驗(yàn)中的最高發(fā)芽率要高出13.7%。由此，利用響應(yīng)面分析法得到的蒙古黃芪種子最佳處理方式可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

3 討 論

蒙古黃芪種子結(jié)構(gòu)緊密，種臍口小，表面角質(zhì)層較厚，種皮含有大量的蠟質(zhì)、油脂和果膠質(zhì)，導(dǎo)致其吸水難度加大，且又有內(nèi)源抑制物的存在，使其在自然狀態(tài)(即不加任何處理)下的發(fā)芽率較低[12]。因此，破除種子硬實(shí)休眠是提高蒙古黃芪種子發(fā)芽率的關(guān)鍵[21]。適宜的磨砂處理時間在不破壞種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的同時，可以破除種皮的角質(zhì)層和硬實(shí)性[14]；適宜溫度和時間的溫水浸種處理在增強(qiáng)種皮吸水吸脹能力的同時，也能稀釋發(fā)芽內(nèi)源抑制物的濃度，從而提高發(fā)芽質(zhì)量[17]。

單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著磨砂時間的增加、浸種溫度的提高、浸種時間的增加，蒙古黃芪種子的發(fā)芽率均呈先增高后降低的趨勢，這與史麗萍等[15]研究結(jié)果有著相似之處。分析原因可能是：磨砂時間過長會不同程度地造成種子破損，嚴(yán)重時導(dǎo)致種皮脫落，造成發(fā)芽率降低；隨著種皮透性的增加，種子進(jìn)入吸水膨脹期后，種子仍暴露在溫度較高的環(huán)境下，對種胚造成了一定傷害，甚至導(dǎo)致小部分種子死亡，造成發(fā)芽率降低；種子在溫水中浸泡快速吸脹，浸種時間過長易導(dǎo)致吸脹損傷，活力下降，造成發(fā)芽率降低。響應(yīng)面分析法一般用來優(yōu)化一些提取工藝和流程參數(shù)[23]，將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于優(yōu)化蒙古黃芪的種子處理方式，與各個因素梯度的正交試驗(yàn)尋求最優(yōu)處理方式相比，可以減少試驗(yàn)的次數(shù)，減輕試驗(yàn)的工作量。響應(yīng)面分析得出浸種溫度對蒙古黃芪種子發(fā)芽率的影響最高，原因可能是蒙古黃芪種子存在一個破除休眠的臨界溫度和致死溫度，當(dāng)外界溫度高于致死溫度時種子死亡，低于臨界溫度則對休眠破除影響較小，只有浸種溫度在兩者之間才能有效提高蒙古黃芪種子的發(fā)芽率。與程瑤等[17]研究結(jié)果相吻合。

另外本試驗(yàn)?zāi)ド疤幚聿捎玫姆椒ㄊ巧凹埓蚰?，但在大?guī)模生產(chǎn)實(shí)踐中，砂紙打摩會帶來很多的不便，因此可以用小型電動磨米機(jī)或種子摩擦機(jī)打磨代替砂紙打摩，原則是不傷及種仁，只破壞種皮即可。在觀察發(fā)芽率期間發(fā)現(xiàn)了濾紙變黃現(xiàn)象，應(yīng)該是種子內(nèi)源抑制物浸出所致，應(yīng)及時對濾紙進(jìn)行更換。

4 結(jié) 論

本研究中通過對磨砂時間、浸種溫度、浸種時間進(jìn)行單因素篩選和響應(yīng)面優(yōu)化，最終確定蒙古黃芪種子處理方式是磨砂時間13 min、浸種溫度56 ℃、浸種時間8 min，在此處理方式下蒙古黃芪種子發(fā)芽率達(dá)90.7%，與預(yù)測值92%相近，比起單因素試驗(yàn)?zāi)茱@著提高蒙古黃芪種子的發(fā)芽率。所優(yōu)化的處理方式合理、可行，能為生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。