張珺,周瑞佳,趙升,李繼業(yè),姚海燕,徐東會(huì),韓龍江

(1.國(guó)家海洋局北海標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量中心 青島 266033;2.國(guó)家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 青島 266033;3.國(guó)家海洋局溢油鑒別與損害評(píng)估技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266033)

黃海海域自2008年至今已連續(xù)暴發(fā)了多次主要由石莼屬(Ulva)大型海洋綠藻類漂浮聚集引發(fā)的綠潮(green tides)災(zāi)害,對(duì)近海海洋生態(tài)系統(tǒng)健康和海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生了重大影響,如不采取有效的防控措施,黃海綠潮災(zāi)害的發(fā)生將呈現(xiàn)常態(tài)化趨勢(shì)[1]?，F(xiàn)階段,對(duì)于滸苔生理學(xué)的研究多集中于外界環(huán)境變化對(duì)于藻體自身的影響方面[2-3],而并未從其機(jī)制方面對(duì)造成這些變化的原因進(jìn)行深入剖析。本研究已經(jīng)對(duì)黃海漂浮綠藻種類組成及時(shí)空分布做了相關(guān)的研究分析,猜測(cè)黃海漂浮綠藻種群演替與時(shí)空分布的變化可能是由于不同地區(qū)的溫度、鹽度及光照的差異造成的,然而影響綠潮暴發(fā)的因素多種多樣,因此,對(duì)于綠藻的培養(yǎng)條件下,溫度、鹽度及光照對(duì)滸苔的生理生態(tài)特征也應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的論證。

本研究將使用葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定儀Phyto-pam(德國(guó)walz),利用葉綠素?zé)晒獾淖兓从抄h(huán)境因子對(duì)藻類光合作用的影響[4]。通過(guò)葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析,反映PSⅡ量子產(chǎn)量[5],一般情況下,植物潛在的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(F v/F m)是一個(gè)很穩(wěn)定的值,反映PSⅡ最大的光能轉(zhuǎn)化效率。有學(xué)者認(rèn)為綠藻的F v/F m 介于0.7～0.75 時(shí),其生理狀態(tài)較為正常[6],因此該參數(shù)可以作為表征植物體生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)重要物理量。

1 材料與試劑

1.1 材料準(zhǔn)備

培養(yǎng)試驗(yàn)所用的滸苔樣品為2018年5—8月取自黃海斷面調(diào)查樣品,經(jīng)培養(yǎng)試驗(yàn)后,滸苔樣品在北海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心生態(tài)效應(yīng)模擬實(shí)驗(yàn)室藻類培養(yǎng)室中進(jìn)行了保種處理。

1.2 主要儀器與試劑

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所需儀器等物品為北海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心生態(tài)效應(yīng)模擬實(shí)驗(yàn)室藻類培養(yǎng)室提供。另外,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析儀器如葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定儀Phyto-pam(德國(guó)walz)等也是由北海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

首先稱取每個(gè)站位的底泥樣品濕重20 g,放于500 m L滅菌的燒杯中,加入滅菌海水400 m L,用玻璃棒充分?jǐn)嚢?靜置15～20 min。然后將燒杯上部較澄清的泥漿轉(zhuǎn)移到另一個(gè)滅菌的燒杯中,丟棄掉沉入底部的較大石粒和沙粒。用滅菌的海水補(bǔ)齊500 m L,再次充分?jǐn)嚢韬?將250 m L的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)已滅菌的燒杯中,隨后的培養(yǎng)方法參考海水樣品的培養(yǎng)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)出的幼苗數(shù)量,可以確定20 g泥樣中的綠藻顯微繁殖體數(shù)量。

2 實(shí)驗(yàn)方法

綠藻生長(zhǎng)過(guò)程中,環(huán)境中海水鹽度、營(yíng)養(yǎng)成分的變化對(duì)其生長(zhǎng)有著重要的影響。為研究不同營(yíng)養(yǎng)條件(尤其是重要的營(yíng)養(yǎng)成分氮和磷的濃度)、鹽度、溫度及光照對(duì)綠藻生長(zhǎng)的影響,對(duì)將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)的滸苔置于不同溫度、不同鹽度及不同光照強(qiáng)度條件下培養(yǎng),每個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣,實(shí)驗(yàn)采用光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),光照周期設(shè)為12 h∶12 h,采用葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定儀Phyto-pam 檢測(cè)藻體光合參數(shù)。

鹽度梯度為0‰、10‰、20‰、30‰、40‰。

溫度 梯 度 為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。

光照梯度為40μmol/(m2·s)、80μmol/(m2·s)、160μmol/(m2·s)、400μmol/(m2·s)。

實(shí)驗(yàn)周期為20周,每隔5天換一次水,3天添加一次營(yíng)養(yǎng)鹽并觀察生長(zhǎng)狀況。

3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)分析,比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著性,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。多重比較采用Dunnett's方法。

4 結(jié)果

4.1 鹽度對(duì)綠藻生長(zhǎng)生理特征影響的研究

在室內(nèi)不同環(huán)境條件下培養(yǎng)2～3天后,藻體的光合放氧速率在鹽度為0‰下顯著降低,比其他鹽度下的要低了59%～64%,其他各鹽度間(10‰～40‰)以及與初始值(圖1虛線)間則都無(wú)明顯差異;培養(yǎng)8天后,鹽度為0‰下,滸苔藻體的光合放氧速率降為負(fù)值,其他各鹽度間則沒(méi)有顯著差異(圖1)。

圖1 鹽度對(duì)滸苔光合生理特征影響

不同鹽度條件下,對(duì)滸苔葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定結(jié)果表明,在鹽度為0‰的條件下,滸苔F v/F m 快速降低,在處理第一天便下降了50%以上,隨后F v/F m 維持在較低水平,脅迫處理6天后,F v/F m無(wú)法測(cè)定。鹽度在10‰～40‰時(shí),在前5天各處理樣品F v/F m 沒(méi)有明顯變化,均維持在0.5～0.6,之后樣品F v/F m 有不同程度的降低,其中鹽度為30‰時(shí),處理樣品F v/F m 降低較為明顯。

圖2 不同鹽度條件下,滸苔F v/F m 變化

4.2 溫度對(duì)綠藻生長(zhǎng)生理特征影響的研究

對(duì)滸苔樣本的室內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,35℃下培養(yǎng)的藻體幾乎全變白,只有部分藻體為淡綠色,光合放氧速率也迅速降為負(fù)值,而其他不同溫度(5℃～30℃)條件下,則都未發(fā)生顯著變化(圖3)。

不同實(shí)驗(yàn)溫度條件下,對(duì)滸苔葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定結(jié)果表明,在5℃～25℃,樣品實(shí)際量子效率F v/F m 隨溫度的上升而逐步升高,之后隨著溫度的進(jìn)一步升高而快速降低。

圖3 溫度對(duì)滸苔光合生理特征影響

對(duì)材料進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)并測(cè)定F v/F m 的結(jié)果可知,在5℃、10℃、15℃下,滸苔樣品F v/F m 在處理第一天便明顯降低,隨后幾天穩(wěn)定在0.4～0.5。在20℃和25℃下,樣品F v/F m 在6天的培養(yǎng)時(shí)間未發(fā)生明顯變化,均維持在0.6左右。30℃處理樣品F v/F m 在處理第一天有所降低,但隨后逐步恢復(fù)到0.6左右。35℃處理樣品F v/F m 明顯受到溫度的影響,在處理第一天后便下降30%以上,之后隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步降低,在處理6天后F v/F m處于一定范圍的波動(dòng)(圖4)。

圖4 不同溫度下培養(yǎng)滸苔F v/F m 變化

不同光照條件下,藻體F v/F m 變化有所不同,處理的前2 天中,所有條件下樣品都有相同幅度的降低,處理第三天時(shí),光強(qiáng)400μmol/(m2·s)下比其他光強(qiáng)下的要顯著低14%～16%;到培養(yǎng)后期,則以160μmol/(m2·s)下要明顯較高,即160μmol/(m2·s)下藻體Fv/Fm 的降低總體較為平緩(圖5)。

圖5 不同光照條件下,滸苔F v/F m 值變化

光照實(shí)驗(yàn)表明,滸苔在低光照條件下的實(shí)際量子效率要高于高光照條件,且最大量子效率的測(cè)定也進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果,表明高光照條件會(huì)引起滸苔光能利用效率的下降。但光照強(qiáng)度的上升對(duì)凈光合放氧速率有促進(jìn)作用,說(shuō)明盡管高光照強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致滸苔對(duì)光能利用效率的降低,但是藻體所吸收利用的光能仍處于較高水平且促進(jìn)了光合放氧量的上升,在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的光照范圍內(nèi),綠藻藻體隨光照強(qiáng)度上升而降低對(duì)所吸收光能的利用效率,但凈光合放氧速率則表現(xiàn)出隨光照強(qiáng)度的提高而上升的趨勢(shì)。

5 討論

滸苔藻體的生長(zhǎng)需要較強(qiáng)的光照和適宜的鹽度、溫度。PSⅡ的最大光量子產(chǎn)量(Fv/Fm),是一個(gè)比較穩(wěn)定的值,在非環(huán)境脅迫條件下極少變化,當(dāng)藻類在不適宜的光照照射時(shí),其自身的光系統(tǒng)會(huì)發(fā)生不同程度的損傷,最終造成光合作用的下降,因此,可以作為表征滸苔對(duì)外界環(huán)境因子適用性的一個(gè)指標(biāo),指示滸苔生理狀態(tài)[5]。針對(duì)幼苗的生長(zhǎng)階段,鹽度可以直接產(chǎn)生影響,高鹽條件會(huì)顯著降低滸苔所有受試群體幼苗的生長(zhǎng)速率,在兩個(gè)近緣種之間具有明顯的差異。Shimada等[7]對(duì)整個(gè)日本沿海石莼屬綠藻的研究也關(guān)注到滸苔與緣管滸苔間地理分布的差異,發(fā)現(xiàn)滸苔主要分布在鹽度較低的河口,而緣管滸苔生活在鹽度較高的沿海區(qū)域,認(rèn)為滸苔的物種形成是對(duì)低鹽適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果。Cai等[8]進(jìn)一步考察了不同鹽度梯度對(duì)石莼屬綠藻分布與季節(jié)變化規(guī)律的影響,同樣發(fā)現(xiàn)滸苔主要分布在低鹽海區(qū),并且不同地理居群對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍不同。

鹽度處理結(jié)果說(shuō)明,在鹽度為0‰的條件下,滸苔對(duì)光能的利用能力下降顯著,漂浮滸苔對(duì)低鹽脅迫很敏感;之前有學(xué)者指出,滸苔在鹽度為0‰的條件下光合活性大幅減弱,不能正常生長(zhǎng),甚至很快死亡[9]。本試驗(yàn)中漂浮滸苔在低鹽度條件下,PSⅡ活性較低,當(dāng)鹽度恢復(fù)到其生長(zhǎng)環(huán)境的正常值后,其PSⅡ活性也都能很快回升。而在鹽度10‰～40‰的條件下,滸苔F v/F m 未發(fā)生非常明顯的變化,說(shuō)明滸苔對(duì)鹽度的適應(yīng)能力很強(qiáng),在較大的鹽度變化范圍內(nèi),其均能夠維持一定的光能利用能力。高鹽度條件下,F v/F m 呈迅速降低趨勢(shì),有研究發(fā)現(xiàn),這是因?yàn)樵诟啕}脅迫下,滸苔內(nèi)一系列機(jī)體變化,致使體內(nèi)蔗糖及脯氨酸生成量增加,增加的蔗糖及脯氨酸又起到了高滲調(diào)節(jié)作用,使?jié)G苔藻體保持了較高的光和活性[10]。受長(zhǎng)江沖淡水的影響,江蘇海域鹽度較山東海域偏低,這與滸苔和緣管滸苔分別在江蘇與青島沿海優(yōu)勢(shì)分布的調(diào)查結(jié)果相符[11-12]。上述研究均未涉及鹽度影響分布的方式與機(jī)制,本研究的發(fā)現(xiàn)可為相關(guān)深入研究提供線索。

鹽度在一定程度上影響藻細(xì)胞的滲透壓、漂浮性、營(yíng)養(yǎng)鹽吸收及光合放氧等,過(guò)高或過(guò)低的鹽度均會(huì)對(duì)藻細(xì)胞造成傷害[13-14],并進(jìn)一步影響海藻的生長(zhǎng)[15],生活在鹽度不同的近海、河口等的海藻對(duì)鹽度的響應(yīng)也各有差異。滸苔是一種廣鹽性綠藻,適鹽范圍約為7‰～53‰[16],并在鹽度為0‰的條件下可存活2～3周[17]。近期的研究表明,相比于緣管滸苔、滸苔的適鹽范圍略廣[18]。在不損傷細(xì)胞膜的前提下滸苔細(xì)胞可反復(fù)進(jìn)行質(zhì)壁分離,以適應(yīng)高鹽、低鹽的環(huán)境[19]。劉榆莎等[19]研究的結(jié)果顯示,滸苔生長(zhǎng)等生理特性對(duì)鹽度的響應(yīng)受溫度的影響,具體表現(xiàn)在:在低溫15℃下,鹽度從10‰增加至25‰對(duì)滸苔生長(zhǎng)的影響不顯著,而在正常溫度(22℃)下,鹽度增加促進(jìn)了滸苔的生長(zhǎng)。一般認(rèn)為鹽度變化影響細(xì)胞的滲透平衡,但其對(duì)藻體的光合色素的影響也有較多的研究[20-22],鹽脅迫能夠破壞植物葉綠體的膜結(jié)構(gòu),葉綠素含量將隨葉綠體膜結(jié)構(gòu)的解體而降低,進(jìn)而降低植物的光合能力。有研究表明,藻體光合色素含量的下調(diào)可在一定程度上避免過(guò)多光能對(duì)藻體造成損傷[23],而光能利用效率的提高在一定程度上可以平衡因?yàn)樯睾康慕档蛯?duì)生長(zhǎng)的影響,環(huán)境脅迫會(huì)破壞光合生物的光合結(jié)構(gòu),損傷光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的反應(yīng)中心,降低電子傳遞速率,并進(jìn)一步抑制PSⅡ的潛在活性[23]。相比于溫度,鹽度對(duì)滸苔葉綠體光合結(jié)構(gòu)未造成顯著影響,表現(xiàn)為同一溫度下,兩個(gè)鹽度處理的滸苔具有相似的光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性而F v/F m 的降低顯示其電子傳遞速率的降低。溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在20℃～30℃范圍內(nèi)滸苔樣品F v/F m 較高,綠藻能夠保持較高的光能利用效率,尤其25℃時(shí)F v/F m達(dá)到最大,當(dāng)溫度低于20℃時(shí),滸苔對(duì)光能的利用能力隨溫度的降低而呈逐漸減弱的趨勢(shì),說(shuō)明滸苔樣品受到了低溫脅迫導(dǎo)致了光合作用利用率下降。而當(dāng)溫度高于30℃時(shí),滸苔同樣受到不利的影響,對(duì)光能的利用效率也明顯降低,通過(guò)溫度的實(shí)驗(yàn),認(rèn)為20℃～30℃范圍是滸苔對(duì)光能有較高利用效率的溫度范圍。

光照實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,滸苔在60～140μmol/(m2·s)的條件下能較好地維持自身的光能轉(zhuǎn)化效率,顯示較強(qiáng)的光照和溫度能夠促進(jìn)藻體的生長(zhǎng),滸苔對(duì)光強(qiáng)有廣泛的適應(yīng)性,其中120μmol/(m2·s)最適合其孢子萌發(fā)生長(zhǎng),高光化學(xué)量子產(chǎn)量能夠反映藻體處于較高的光合作用水平,可以產(chǎn)生更多利于生長(zhǎng)的化學(xué)因子[6]。方差分析顯示光照對(duì)藻體最大光化學(xué)量子產(chǎn)量的影響顯著。