寧佳羽，包偉晶，周素娟，魏日富，朱忠壽

0 引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是咽上皮細胞癌，好發(fā)于中國南部地區(qū)且有家族聚集傾向，提示遺傳易感性在鼻咽癌的發(fā)生中起著關鍵作用[1]。癌癥的發(fā)生發(fā)展隨著時間推移會發(fā)生累積表觀遺傳的變化，主要表現(xiàn)為癌基因的激活和（或）抑癌基因的抑制。調控性非編碼RNA（ncRNAs）按其功能可分為兩類：管家ncRNAs和監(jiān)管ncRNAs，其中大于200個核苷酸的稱為長鏈非編碼RNAs（LncRNAs）[2]。研究表明LncRNA靶點與多種癌癥的發(fā)展及預后相關，如LncRNA MEG3可作為多種miRNAs的競爭性內源RNA（ceRNA）而發(fā)揮作用，通過下調MEG3的表達導致miRNAs的變化，從而影響目標mRNAs的表達水平[3-4]。MEG3位于人類染色體14q32.3上，研究顯示MEG3可通過調節(jié)抑癌基因、抑制血管生成及控制miRNA而發(fā)揮抑癌作用[5]。同時研究還發(fā)現(xiàn)MEG3序列中有與miR-543互補的miRNA應答元件（MRE），而miR-543與癌癥發(fā)生發(fā)展關系密切已得到證實，其中Krüppel樣因子4（KLF4）作為miR-543的靶基因在其中發(fā)揮重要作用[6-7]。

近年來也不乏關于MEG3、miR-543在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中所起作用的研究[8-9]，但具體機制的闡述仍不夠清晰，本研究擬通過檢測MEG3與miR-543在鼻咽癌細胞中的表達情況，分析MEG3、miR-543和KLF4與鼻咽癌的關系，以揭示他們在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用，旨在為未來鼻咽癌的治療中將MEG3作為一個可能靶點提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

鼻咽癌細胞株（CNE-2、C666-1和TW03）和人正常鼻咽上皮細胞株NP69均購自上海中國科學院。細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）

采用NucleoZOL（德國Machery Nagel GmbH公司）從細胞中分離總RNA、評估其完整性，ABI7500系統(tǒng)行qRT-PCR檢測MEG3、miR-543和KLF4的表達情況。引物序列如下：MEG3-F:5'-GGGAAGGGACCTCGAATGTG-3',MEG3-R:5'-CTGTCCCGTGGGAATAGGTG-3'；miR-543-F:5'-CGAAACATTCGCGGTGCA-3'；miR-543-R:5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'和miR-543-RT:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT CGCACTGGATACGACAAGAAG-3'。以GAPDH和U6為內參對照，特異性引物如下：GAPDH-F:5'-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3',GAPDH-R:5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'；U6-F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，U6-R:5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'和RT引物5'-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。用2-ΔΔCt法計算相對基因表達量。

1.3 細胞轉染與分組

si-MEG3、pcDNA-MEG3、miR-543模擬物、miR-543抑制劑、si-KLF4和pcDNA-KLF4購自中國上?；蛑扑幑尽Ｈ∨囵B(yǎng)至對數(shù)期的鼻咽癌細胞和鼻咽上皮細胞參照Lipofectamine2000試劑盒（Invitrogen公司，美國）進行轉染，并分成空白對照組（NC）、陰性轉染組和實驗組。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

將細胞接種到96 孔板中，分別于轉染后0、24、48、72、96 h加入10%CCK8溶液（CK04Dojindo）100 μl，37℃孵育2 h，微板儀測450 nm處的吸光度值。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

細胞培養(yǎng)過夜、80%～90%融合時轉染，在5%CO2環(huán)境中用胰蛋白酶消化、離心后收獲細胞，用PBS洗滌，再與結合緩沖液混合后，在Annexin V-FITC和PI染色液室溫黑暗條件下孵育15 min。

1.6 雙熒光素酶測定法

使用TargetScan數(shù)據(jù)庫（http://www.targetscan.org/vert_71/）預測miR-543靶基因。將MEG3-WT（5‘-GAGUAAUGGUAGUGAA UGUU-3’）和MEG3-MUT（5‘-GAGUAAUGGUAGUCAGAUCAU-3’）可能的結合序列克隆至pcDNA3.1載體上，與miR-543模擬或陰性對照共轉染C666-1細胞，36 h后雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)（Promega公司，美國）分析螢火蟲和雷尼拉信號。熒光素酶活性用微量平板閱讀器定量。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達

用RIPA緩沖液分離總蛋白、10%SDS-PAGE分離并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白質定量分析采用Bradford法，用皮爾斯ECL試劑盒顯示PVDF膜上的靶蛋白條帶?？贵w稀釋如下：抗KLF（1:1000）、抗Bcl-2（1:1000）和抗bax（1:1000）；以抗β-肌動蛋白（1:1000）作為內參。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均用均值±標準差（）表示，并用SPSS20.0統(tǒng)計軟件行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析（ANOVA）確定各組數(shù)據(jù)差異的統(tǒng)計學意義。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人鼻咽癌細胞系中MEG3與miR-543的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，與正常鼻咽上皮細胞系NP69相比，CNE-2、C666-1和TW03中MEG3表達水平降低，miR-543表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（F=58.137,P＜0.001），見圖1。

2.2 鼻咽癌細胞中MEG3直接吸附轉染miR-543

圖1 qRT-PCR檢測鼻咽癌細胞與正常鼻咽上皮細胞中MEG3(A)和miR-543(B)的表達Figure 1 Expression of MEG3(A) and miR-543(B) in NPC cells and normal nasopharyngeal epithelial cells determined by qRT-PCR

生物信息學預測顯示MEG3以miR-543為靶點，于是構建了MEG3野生型和突變型熒光素酶報告載體并轉染細胞。熒光素酶活性測定結果表明：與NC組相比，miR-543模擬物明顯降低了MEG3野生型報告基因組的熒光素酶活性（F=18.824,P=0.001），而對MEG3突變型報告基因組中的熒光素酶活性沒有可檢測到的影響（F=1.337,P=0.310），見圖2，提示鼻咽癌細胞中MEG3以miR-543為調控靶點，且二者間存在負調節(jié)關系。

2.3 MEG3吸附轉染miR-543可提高KLF4的表達水平

圖2 MEG3野生型和突變型為載體在miR-543模擬物結合位點上共轉染鼻咽癌細胞的雙熒光素酶報告分析Figure 2 Dual luciferase reporter analysis of MEG3 wild-and mutant-types as vectors co-transfected with nasopharyngeal carcinoma cells at miR-543 mimetic binding site

結果顯示，MEG3過表達可顯著降低miR-543的表達水平，而pcDNA-MEG3與miR-543的共轉染模擬質?？赡孓DpcDNA-MEG3對miR-543表達的抑制作用，與NC組、陰性轉染組相比，組間差異均有統(tǒng)計學意義（F=4333.00,P＜0.001），見圖3A；MEG3過表達顯著促進KLF4的表達，而與pcDNA-MEG3共轉染的miR-543模擬質?？赡孓DpcDNA-MEG3對KLF4表達的促進作用，與NC組、陰性轉染組相比，組間差異均有統(tǒng)計學意義（F=3739.947,P＜0.001），見圖3B；下調MEG3可顯著降低KLF4表達水平，而將miR-543抑制劑與si-MEG3共轉染可緩解si-MEG3對KLF4表達的抑制作用，與NC組、陰性轉染組相比，組間差異均有統(tǒng)計學意義（F=13056.846,P＜0.001），見圖3C。

2.4 MEG3通過調控KLF4的表達進而調控鼻咽癌細胞的增殖與凋亡

圖3 MEG3吸附轉染miR-543可提高KLF4的表達水平Figure 3 MEG3 could regulate KLF4 expression by absorptively transfecting miR-543

研究結果顯示si-MEG3促進鼻咽癌細胞增殖、pcDNA-MEG3抑制鼻咽癌細胞增殖，但pcDNAKLF4共轉染可逆轉si-MEG3對C666-1細胞增殖的促進作用，而與si-KLF4共轉染可解除pcDNAMEG3對細胞增殖的抑制作用，與NC組、陰性轉染組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（F=8.886,P=0.007;F=5.778,P=0.024），見圖4A；si-MEG3抑制細胞凋亡，而si-MEG3和pcDNA-KLF4共轉染減輕了其對細胞凋亡的抑制作用，與此同時pcDNA-MEG3誘導細胞凋亡，而pcDNA-MEG3和si-KLF4共轉染抑制了其對細胞凋亡的促進作用，與NC組、陰性轉染組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（F=545.042,P＜0.01;F=1114.926,P＜0.001），見圖4B。

Western blot檢測結果顯示，MEG3敲除后Bcl-2的表達增高、Bax的表達降低，而提高KLF4的表達可逆轉此效應，與NC組、陰性轉染組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（F=2191.592,P＜0.001;F=9548.143,P＜0.001），見圖4C；反之，MEG3過表達降低Bcl-2的表達、升高Bax的表達，但KLF4的表達下調可逆轉此效應，與NC組、陰性轉染組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（F=37.781,P＜0.05;F=15183,P＜0.001），見圖4D。

因此，MEG3可通過調控KLF4蛋白的表達進而調控鼻咽癌細胞C666-1的增殖與凋亡。

3 討論

鼻咽癌是發(fā)生在鼻咽部的上皮源性惡性腫瘤，在我國南部及東南亞地區(qū)高發(fā)，其病理類型多為低分化鱗癌（98%），惡性程度高，轉移早，晚期鼻咽癌即便經(jīng)積極治療但總體預后仍較差[10]。因此，尋求新的療法以改善鼻咽癌患者總體治療效果顯得尤為必要。

圖4 MEG3可通過影響KLF4的表達來調控鼻咽癌細胞的增殖與凋亡Figure 4 MEG3 could regulate proliferation and apoptosis of NPC cells by affecting KLF4 expression

LncRNAs已被證實可通過調節(jié)靶基因的表達參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，越來越多的研究表明LncRNAs在細胞癌變過程中可作為癌基因或抑癌因子而存在[11]。而MEG3作為LncRNAs中的重要成員之一在多數(shù)正常組織中表達，但在許多惡性腫瘤中顯示表達下調甚至缺失，如在非小細胞肺癌中低表達，表達水平與腫瘤TNM分期、總體預后關系密切[12]；在乳腺癌動物移植瘤模型中也觀察到MEG3可抑制腫瘤生長、轉移及瘤內血管的生成[13]；還有研究發(fā)現(xiàn)胃癌中MEG3的表達明顯下降，且下降程度與腫瘤進展及轉移呈負相關[14]。但MEG3在鼻咽癌中的作用及相關機制目前仍不清楚，故本研究旨在通過探討鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子生物基礎，尋找到可靠的新型生物標志物，最終為臨床開展鼻咽癌分子靶向治療提供有益的思路及實驗基礎。

有研究發(fā)現(xiàn)一些LncRNAs可通過與miRNAs直接結合來抑制其表達而充當ceRNAs（即“miRNA海綿”）的作用[15]；而既往研究顯示在不同癌細胞中miR-543的作用存在差異，且KLF4作為miR-543的靶基因可通過參與細胞增殖并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作為腫瘤抑制因子及預后指標而發(fā)揮作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)MEG3在鼻咽癌細胞中的表達水平明顯降低，并觀察到MEG3對癌細胞生物學行為的多效性調節(jié)：MEG3過表達能夠抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，還可通過靶向調節(jié)miR-543并作為KLF4的ceRNA而發(fā)揮腫瘤抑制作用。此外，本研究進一步驗證了KLF4為鼻咽癌細胞miR-543的靶基因，miR-543可通過下調KLF4表達從而抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡以進一步達到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的目的。同時本研究還發(fā)現(xiàn)KLF4在鼻咽癌細胞中可通過調節(jié)Bcl-2與Bax蛋白的表達來發(fā)揮抑癌作用，提示KLF4可能是鼻咽癌預后的重要預測指標。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)上調MEG3表達可抑制鼻咽癌細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡，與miR-543的表達呈負相關，而miR-543又可通過下調KLF4的表達來發(fā)揮抑癌作用，揭示了MEG3在鼻咽癌細胞可通過MEG3-miR-543-KLF4軸的反饋調節(jié)達到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的目的，提示MEG3可能會成為鼻咽癌靶向治療的一種新型生物標志物。但本研究僅處于鼻咽癌的細胞層面上，MEG3-miR-543-KLF4反饋系統(tǒng)在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的確切機制及可能的臨床應用還有待進一步的研究來揭示。