康燁 王瑞娜 閻瀾

(1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科, 沈陽 110016; 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)軍特藥研究中心， 上海 200433)

真菌感染在過去的幾十年間增長迅速，其主要原因是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進步(器官移植和化療)和HIV感染全球流行等原因造成易感染免疫受損人群增加[1]。目前可用的抗真菌藥物主要分為唑類、多烯類、棘白菌素類、丙烯胺類和氟胞嘧啶類。這些抗真菌藥物通常以麥角甾醇生物合成途徑、真菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁或真菌DNA/RNA為靶點[2]。問題是，這些抗真菌藥物在毒性、活性譜、安全性和藥代動力學(xué)特性方面存在各種缺點[3]。此外，隨著這些抗真菌藥物的長期大規(guī)模應(yīng)用，耐藥率也有了顯著的提高[4]。因此，尋找新的抗真菌藥物，制定新的策略來對抗真菌感染是至關(guān)重要的。本文就真菌特異性或高選擇性靶點及相關(guān)化合物，按照不同作用機制做一綜述。

1 真菌細(xì)胞壁合成

真菌細(xì)胞壁是一個高度變化的結(jié)構(gòu)，主要參與多種形態(tài)發(fā)生過程、細(xì)胞生長、胞質(zhì)分裂和特殊類型真菌細(xì)胞發(fā)育[5]。真菌感染過程中，細(xì)胞壁是病原體與宿主建立聯(lián)系，產(chǎn)生致病性和毒力的重要因素[6]。

糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白廣泛存在于真菌細(xì)胞壁上，在真菌與宿主細(xì)胞的黏附中起著重要作用。肌醇?；D(zhuǎn)移酶(Gwt1)催化GPI錨定蛋白生物合成途徑的早期步驟，是manogepix(MGX,PX001A)的作用靶點[7]，該酶與最接近的哺乳動物直系同源物顯示出低同源性(<30%氨基酸序列同一性)[8]。抑制Gwt1可阻止甘露糖蛋白的正確定位[9]，損害真菌細(xì)胞壁完整性，抑制生物膜產(chǎn)生及菌絲形成，造成嚴(yán)重的生長缺陷[10]。manogepix(APX001A)可抑制真菌Gwt1但對人類Gwt1同源物Pig-W沒有作用[11]，這表明該化合物對真菌細(xì)胞具有選擇性。fosmanogepix(APX001)是manogepix的前體藥，在I期臨床研究中，其口服或靜脈給藥均有良好的耐受性[12]，目前正在進行侵襲性念珠菌病的II期臨床試驗。manogepix對念珠菌屬和曲霉菌的體外活性研究表明，這種新的抗真菌化合物對白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌等均具有較低的最低抑菌濃度(MIC)，對新生隱球菌也具有較高活性[1]。Gebremariam等[14]在構(gòu)建中性粒細(xì)胞減少性鼠毛霉病模型中發(fā)現(xiàn)，給予藥物fosmanogepix(104mg/kg)組的小鼠，其組織清除率及存活率與使用藥物艾沙康唑硫酸酯(ISA)相當(dāng)，該結(jié)果為fosmanogepix成為抗毛霉病的治療藥物提供了進一步支持。

2 線粒體功能抑制

線粒體是真核細(xì)胞的動力源，通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化作用產(chǎn)生大部分細(xì)胞ATP庫。線粒體在能量代謝中的作用包括氨基酸和磷脂的合成，磷脂與呼吸一起控制衰老、毒力和抗真菌藥物耐藥性等過程[15]。盡管真菌和人類的線粒體基因組具有高度相似性，但真菌特異性蛋白(如酵母Nuo1和Nuo2)有望成為選擇性抗真菌制劑的開發(fā)目標(biāo)[16]。

2.1 活性氧

氧化損傷內(nèi)源性活性氧(ROS)是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，主要在線粒體中產(chǎn)生[17]。ROS的過量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的損傷[18-19]。從紫蘇及香茅屬植物中提取的抗真菌天然單萜類紫蘇醛、香茅醛可以引起白念珠菌中ROS的積累，從而導(dǎo)致白念珠菌細(xì)胞壞死，線粒體功能障礙和DNA損傷[20]。熱穩(wěn)定抗真菌因子HSAF(heat-stable antifungal factor)是產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株的主要次級代謝產(chǎn)物，具有大環(huán)內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，可通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生促使白念珠菌凋亡[21]。

2.2 T-2307

芳基胺T-2307，體外對念珠菌、曲霉和隱球菌具有殺菌活性，可預(yù)防小鼠的播散性感染[22]，該化合物由真菌細(xì)胞通過高親和力的精胺和亞精胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)攝取，可抑制整個酵母細(xì)胞和分離的酵母細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈復(fù)合物III和IV，破壞線粒體膜電位[23]，但對大鼠肝線粒體功能幾乎沒有影響[24]，這是選擇性破壞酵母線粒體功能和抗真菌活性的關(guān)鍵[25]。T-2307對念珠菌有很強的體內(nèi)、外活性，包括耐唑類和棘白菌素類的念珠菌屬、新生隱球菌等[26]。T-2307的體外活性遠(yuǎn)優(yōu)于氟康唑、伏立康唑、米卡芬凈和兩性霉素B；對曲霉菌屬的體外活性與米卡芬凈和伏立康唑的活性相當(dāng)[27]。

3 代謝途徑

3.1 乙醛酸循環(huán)

乙醛酸循環(huán)是對三羧酸循環(huán)(TCA)的一種修改，它允許使用兩種碳源，繞過TCA循環(huán)的CO2生成步驟，使碳被保留為糖異生的底物。該循環(huán)對攝取和利用不可發(fā)酵的碳源(如乙醇、脂肪酸)至關(guān)重要，使真菌細(xì)胞能夠適應(yīng)并在宿主營養(yǎng)條件有限的情況下生存[28]。

異檸檬酸裂解酶(ICL)和麥芽酸合成酶是乙醛酸循環(huán)中涉及的關(guān)鍵酶，其中ICL是真菌產(chǎn)生毒力的必需酶[29]，不存在于人類基因組中，為針對這一代謝途徑的新型抗真菌藥物的設(shè)計開辟了新的前景。ICL抑制劑對不同種類真菌具有高活性并對白念珠菌在巨噬細(xì)胞吞噬后的存活至關(guān)重要。宿主感染期間，病原微生物如煙曲霉、白念珠菌等可引起乙醛酸循環(huán)上調(diào)[30]。

3.2 鈣調(diào)磷酸酶

真菌對棘白菌素類耐藥性的產(chǎn)生，除FKS基因突變外，真菌細(xì)胞內(nèi)的多種途徑應(yīng)激反應(yīng)被激活也是主要原因之一，包括蛋白激酶C(PKC)、鈣調(diào)磷酸酶和分子伴侶Hsp90介導(dǎo)的細(xì)胞壁完整性信號的激活，這對真菌適應(yīng)棘白菌素類環(huán)境并引發(fā)代償機制，如幾丁質(zhì)合成酶的上調(diào)至關(guān)重要[31-32]。

鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定、細(xì)胞周期、形態(tài)轉(zhuǎn)變、交配和胞質(zhì)分裂[33]。抑制鈣調(diào)磷酸酶信號傳導(dǎo)是一種新策略，既能減弱真菌毒力，又能提高現(xiàn)有抗真菌藥物的有效性，同時抑制真菌的耐藥性[34]。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑FK506(他克莫司)對多種致病真菌具有活性。FK506由于具有較強的免疫抑制活性，不能作為抗真菌化合物使用，但已開發(fā)出幾種具有較低細(xì)胞毒性和免疫抑制活性的FK506類似物(9D-、9DP-、31OD-、9D31OD-FK506)。除9DP-FK506外，這些類似物對煙曲霉、白念珠菌和新生隱球菌都顯示出有效的抗真菌活性，而31OD-和9D31OD-FK506也與氟康唑具有協(xié)同作用。在系統(tǒng)性隱球菌病小鼠模型中，9D31OD-FK506與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用顯著延長了受感染小鼠的存活時間[35]。此外，Juvvadi等[36]用乙酰肼取代FK506的C22羰基，開發(fā)出一種FK506類似物APX879，該化合物在侵襲性真菌感染的小鼠模型中，表現(xiàn)出較低的免疫抑制和廣譜抗真菌活性。

3.3 熱休克蛋白Hsp90

Hsp90是一種重要的、高度保守的分子伴侶，可促進蛋白核糖核酸折疊、組裝和成熟。Hsp90抑制劑與唑類和棘白菌素類藥物聯(lián)合應(yīng)用對白念珠菌的抗真菌活性具有潛在的協(xié)同作用[37]。Hsp90通過其關(guān)鍵的下游效應(yīng)器—鈣調(diào)磷酸酶和MKC1激酶調(diào)節(jié)唑類耐藥[38]。白念珠菌Hsp90功能受損導(dǎo)致生物膜對唑類耐藥性消失，此外，Hsp90表達減少導(dǎo)致基質(zhì)葡聚糖水平顯著降低[39]。目前，Hsp90抑制劑因其對宿主的毒性作用，不能作為抗真菌藥物使用，但Whitesell等[40]通過對白念珠菌Hsp90的核苷酸結(jié)合域(NBD)的研究，合成了對真菌Hsp90—NBD具有選擇性的抑制劑，這為Hsp90抑制劑成為低細(xì)胞毒性的抗真菌藥物提供了可行性。

4 表觀遺傳抑制

表觀遺傳是指在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)，包括DNA甲基化、RNA干擾、組蛋白質(zhì)修飾、染色質(zhì)改型。Torres-Garcia等[41]研究發(fā)現(xiàn)，真菌細(xì)胞可以通過改變DNA的包裝方式即表觀遺傳變化，而非DNA序列來產(chǎn)生抗藥性。

4.1 組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶/脫乙?；?/h3>

真菌蛋白質(zhì)乙酰化是通過在賴氨酸殘基的Nε-氨基中加入乙?；?，消除該氨基酸的正電荷而發(fā)生的。這種修飾可通過影響蛋白質(zhì)的催化活性、與其他蛋白質(zhì)相互作用的能力或其亞細(xì)胞定位而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變[42]。目前鑒定出乙?；潭茸罡叩牡鞍踪|(zhì)組來自紅色毛癬菌(23.3%)、解脂耶氏酵母(22.1%)、釀酒酵母(19.6%)、新生隱球菌(19.60%)和煙曲霉(23.90%)[43-45]。在釀酒酵母和解脂耶氏酵母這兩種非致病真菌中，大多數(shù)乙?；鞍追謩e參與葡萄糖/氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)[45]，而白念珠菌中乙?；牡鞍撞粌H參與糖酵解和氧化磷酸化，還與組蛋白乙?；嘘P(guān)，包括與白念珠菌毒力相關(guān)的H3K56ac[46]。對新生隱球菌、煙曲霉和白念珠菌的研究顯示，40%的致病性相關(guān)因子被乙?；?，表明它們的功能可能受到組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶的影響[43]。組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶家族分為三類：GNAT(與Gcn5相關(guān)的N-乙?；D(zhuǎn)移酶)，MYST(MOZ，Ybf2 / Sas3，Sas2，Tip60)和p300 / CBP(300 kDa蛋白和CREB結(jié)合蛋白)，其中MYST家族僅存在于真核細(xì)胞，p300 / CBP為后生動物所特有[47]。Rtt109是真菌特異性的組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶[46]。

組蛋白脫乙?；?histone deacetylases, HDACs)是一種去除核心組蛋白賴氨酸殘基的酶，它控制基因的轉(zhuǎn)錄和表達并對一些非組蛋白(如Hsp90)具有調(diào)控作用[48]。MGCD290是一種抑制真菌HDACs2的新型抗真菌藥物[49]，該藥物以組蛋白脫乙?；?HDACs)為靶點，抑制其對蛋白的脫乙酰作用，這些蛋白對真菌病原體毒力、耐藥性和形態(tài)轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)(通常使轉(zhuǎn)錄和基因表達下調(diào))起關(guān)鍵作用[50]。MGCD290與其他抗真菌藥物如唑類、棘白菌素類具有協(xié)同作用[51]。在抗突變菌株中，MGCD290可降低MICs，恢復(fù)真菌對藥物的敏感性[52]。

4.2 溴結(jié)構(gòu)域(BD)

溴結(jié)構(gòu)域和末端外結(jié)構(gòu)域(BET)家族蛋白是與染色質(zhì)相關(guān)的因子，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)重塑[53-54]。BET蛋白通過其兩個溴結(jié)構(gòu)域(BD：BD1和BD2)與染色質(zhì)結(jié)合，從而識別特定的乙酰化組蛋白[55]。研究表明，小分子抑制劑，如JQ1、I-BET和I-BET762，不僅對BET BDs具有高親和力，而且具有高特異性[56]。這使得BET家族蛋白成為癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥等主要疾病的重要治療靶點[55]，以此來開發(fā)可通過抑制乙?；旧|(zhì)相互作用來調(diào)節(jié)基因表達的抑制劑[57]。釀酒酵母的BET蛋白Bdf1是一種全面轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)500多個基因，Bdf1的破壞導(dǎo)致嚴(yán)重的形態(tài)變化和生長缺陷。Mietton等[53]研究顯示，BDF1對白念珠菌是至關(guān)重要的，其突變體表現(xiàn)出體外活力的喪失以及體內(nèi)毒力降低。小分子抑制劑(如二苯并噻嗪酮、咪唑吡啶)可以選擇性地靶向白念珠菌Bdf1中的BD1和BD2，而不會損害人的BET-BD功能。這些發(fā)現(xiàn)為 Bdf1 BDs抑制劑作為一類新型抗真菌藥物奠定了基礎(chǔ)。

5 毒力相關(guān)因子

5.1 鐵元素

鐵是多種蛋白質(zhì)不可或缺的輔助因子，是真菌細(xì)胞呼吸和DNA合成等多種代謝過程的先決條件，是重要的毒力因子。真菌細(xì)胞在鐵含量足夠高時，定植和擴散更加明顯[58]。

VL-2397(ASP2397)是從桃色頂孢霉菌中分離出的環(huán)六肽，在結(jié)構(gòu)上與低分子量鐵載體鐵鉻相似[59]。Nakamura等[60]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加0.03 mmol/L的鐵可使煙曲霉的VL-2397 MIC從1增加到2 mg/L，而添加鐵螯合劑BPS可將VL-2397的MIC從1降低到0.06 mg/L；這一結(jié)果表明，VL-2397的活性受鐵的有效性影響。盡管其特定的細(xì)胞靶點尚不清楚，但它是由人類細(xì)胞中不存在的鐵載體蛋白(Sit1)轉(zhuǎn)運至真菌細(xì)胞，特別是煙曲霉，繼而觸發(fā)一種有效和快速的抗真菌作用，缺乏Sit1的煙曲霉細(xì)胞對VL-2397表現(xiàn)出抗性。此外，活細(xì)胞成像表明VL-2397可導(dǎo)致菌絲延長停止[61]，且與現(xiàn)有藥物相比，它顯示出快速的抑制作用(在最初的2～4 h內(nèi))和有效的體外抗菌絲伸長的殺菌活性[62]。

5.2 白念珠菌毒素

一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞溶解性肽毒素，念珠菌溶血素(candidalysin)，由ECE1基因(該基因是菌絲形成后表達最多的基因之一)編碼，是白念珠菌重要的毒力因子，它通過破壞宿主的免疫細(xì)胞膜來對抗巨噬細(xì)胞的抗菌活性；同時，candidalysin刺激活化蛋白1(AP-1)的轉(zhuǎn)錄因子C-FOS(通過P38有絲分裂活化蛋白激酶MAPK)和MAPK磷酸酶MKP1(通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2[ERK1/2]-MAPK)，觸發(fā)和調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子反應(yīng)[63]。在致病過程中，candidalysin通過鉀外排觸發(fā)NLRP3炎癥依賴性caspase-1激活，并作為宿主巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞非炎癥依賴性細(xì)胞溶解的主要促進劑[64]。這些研究表明candidalysin既作為毒力因子促進真菌的免疫逃逸，又可作為無毒力因子助力抗真菌的免疫應(yīng)答[65]。

5.3 群體感應(yīng)分子

群體感應(yīng)分子法尼醇對生物膜的形成至關(guān)重要，當(dāng)法尼醇積累到一定閾值水平，可阻礙白念珠菌酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變，抑制生物膜形成。此外，外源性法尼醇也可通過抑制翻譯來限制釀酒酵母的生長及白念珠菌的菌絲形成[66]。Kovavs等[67]已證實，法尼醇可增強棘白素類對假絲酵母念珠菌生物膜的活性。除形態(tài)轉(zhuǎn)化，法尼醇還影響酵母其他生化途徑，如通過積聚活性氧來破壞基本細(xì)胞的麥角甾醇生物合成或觸發(fā)凋亡途徑[68]。

6 總結(jié)與展望

過去十年，真菌病原體的感染率與耐藥性不斷增加，但抗真菌治療藥物的進展有限，大多數(shù)最近批準(zhǔn)或正在開發(fā)的藥物是由唑類和棘白菌素的衍生物組成，致使臨床抗真菌治療仍然受到阻礙。本文所述的抗真菌藥物靶點及化合物，特別是一些真菌特異性的蛋白、途徑及小分子抑制劑，對哺乳動物細(xì)胞表現(xiàn)出低毒性、良好的藥理學(xué)特性和更廣泛的活性譜。對它們進一步的深入研究有望加速新型抗真菌藥物的更新，為臨床提供更多的選擇。