房凌旭 梁海 王鵬遠(yuǎn) 盧中一 陳芳艷 韓黎

(1.深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院口腔科，深圳 518067；2.深圳大學(xué)高等研究院深圳市海洋微生物組工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060；3.中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心消毒與感染控制科，北京 100071)

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是自然界中廣泛存在的曲霉屬真菌，其對(duì)化療患者、血液干細(xì)胞和器官移植患者等免疫力低下人群具有條件致病性?，F(xiàn)有研究顯示，由煙曲霉感染引起的患者死亡率較高，例如侵襲性肺曲霉病致死率超過(guò)30%[1-2]。唑類藥物是臨床上治療煙曲霉感染的一線藥物，其作用機(jī)制是通過(guò)自身的唑環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合煙曲霉麥角甾醇合成通路中關(guān)鍵催化酶——羊毛甾醇14-α-脫甲基酶(sterol 14 α-demethylase，Cyp51)活性中心的血紅素，從而抑制該酶對(duì)底物的催化作用，一方面導(dǎo)致煙曲霉細(xì)胞膜中麥角甾醇含量下降，另一方面導(dǎo)致麥角甾醇合成通路中有毒性的中間產(chǎn)物積累，最終抑制煙曲霉生長(zhǎng)[2]。然而，由于Cyp51(及其在酵母等屬中的直系同源蛋白Erg11)是抗人類及植物多種致病真菌藥物的主要靶點(diǎn)，臨床和農(nóng)業(yè)中唑類藥物被廣泛應(yīng)用，這導(dǎo)致煙曲霉對(duì)唑類藥物的耐受水平不斷升高，且產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要機(jī)制與Cyp51有關(guān)[3]。

Cyp51的兩個(gè)旁系同源蛋白Cyp51A和Cyp51B是煙曲霉的兩個(gè)保守蛋白[4]。其中，煙曲霉Cyp51A的功能研究較為詳細(xì)，例如該蛋白氨基酸位點(diǎn)G54、L98、Y121、G138、M220和G448的突變可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)變化，從而降低該蛋白與唑類藥物的結(jié)合能力，最終導(dǎo)致煙曲霉對(duì)唑類藥物耐受水平的升高[5]。特別是煙曲霉Cyp51A的TR34/L98H突變型和TR46/Y121F/T289A突變型被認(rèn)為是臨床和環(huán)境中煙曲霉的重要耐藥機(jī)制[6-7]。此外，轉(zhuǎn)錄調(diào)控子SREBP和蛋白酶RbdB等關(guān)鍵調(diào)控蛋白的突變可引起煙曲霉cyp51A表達(dá)水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致菌株對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐受性[8-9]。然而，煙曲霉Cyp51B的生物學(xué)功能研究卻鮮有報(bào)道[10-11]。通常認(rèn)為，煙曲霉Cyp51B具有脫甲基酶的功能，可能是一種功能冗余蛋白[12]。然而， Cyp51B在曲霉屬真菌中廣泛存在，這提示在曲霉屬最近共同祖先中Cyp51B可能已存在；另一方面，鐮刀菌屬等真菌中存在多個(gè)Cyp51旁系同源蛋白，且這些蛋白已出現(xiàn)功能分化[12]。因此，煙曲霉Cyp51A和Cyp51B在長(zhǎng)期演化過(guò)程中可能產(chǎn)生功能差異，但是目前為止對(duì)煙曲霉Cyp51A和Cyp51B功能比較的研究仍鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生分析、基因編輯技術(shù)、唑類藥物敏感性檢測(cè)、高溫敏感性檢測(cè)和大蠟螟幼蟲(chóng)致病力實(shí)驗(yàn)等綜合分析煙曲霉Cyp51A和Cyp51B功能的差異性，為解析這些重要藥物靶點(diǎn)生物學(xué)功能，進(jìn)而科學(xué)防控?zé)熐垢腥竞湍退幪峁├碚撘罁?jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 煙曲霉菌株CEA17ΔKu80由法國(guó)巴斯德研究所Jean Paul Latgé教授惠贈(zèng)。本研究中將該菌株定義為野生株(WT)；此外，本研究在該菌株基礎(chǔ)上分別敲除cyp51A和cyp51B的編碼基因獲得突變株Δcyp51A和Δcyp51B。

培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)和沙堡弱培養(yǎng)基(SDA)購(gòu)買(mǎi)自青島海博生物公司?；A(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(MM)由本實(shí)驗(yàn)室配制，主要成分包括微量元素溶液、20×鹽溶液、葡萄糖和瓊脂[13]。

實(shí)驗(yàn)儀器 9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI公司)；A2型二級(jí)生物安全柜(Thermo公司)；HNY-200B振蕩搖床(歐諾公司)；凝膠成像儀(天呈科技公司)；恒溫培養(yǎng)箱(黃石器械廠)；5804R和5417R型臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf公司)；DYY-7C型轉(zhuǎn)印電泳儀電源及配套電泳槽(北京六一公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù) 本研究中Cyp51A、Cyp51B和Erg11序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)時(shí)使用MUSCLE(V3.8.1551)對(duì)蛋白序列進(jìn)行序列對(duì)齊[14]；隨后使用TrimAI(V1.4)進(jìn)行序列剪切[15]；最后利用IQ-Tree(V1.6.5)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[16]，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建模型為L(zhǎng)G+G4。

構(gòu)建突變盒 采用Overlap PCR技術(shù)構(gòu)建含潮霉素突變盒，使用的高保真酶Prime STAR GXL購(gòu)自于大連寶生物公司。PCR體系為：1 μL Prime STAR GXL DNA Polymerase；4 μL dNTP Mixture；10 μL 5×Primer STAR GXL Buffer；1.5 μL正向引物(10 μmol/L)；1.5 μL反向引物(10 μmol/L)；30 μL滅菌去離子水；1 μL DNA模板(2.5～10 ng)。PCR反應(yīng)條件：98℃ 5 min；(98℃ 10 s，60℃15 s，68℃ 1 kb/min)30循環(huán)；68℃ 4 min。使用的相關(guān)引物見(jiàn)表1。

表1 本研究中構(gòu)建突變盒的引物Tab.1 Primers used to construct mutant cassette in this study

煙曲霉原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化 煙曲霉原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化的方法參考前人報(bào)道[13]。具體實(shí)驗(yàn)步驟為，將約106個(gè)煙曲霉CEA17ΔKu80的孢子接種至PDA液體培養(yǎng)基，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，用滅菌紗布收集菌絲。隨后在30℃下將菌絲在細(xì)胞壁消化體系中孵育3 h，并使用40 μm孔徑細(xì)胞網(wǎng)篩去除未消化菌絲后獲得煙曲霉原生質(zhì)體。用洗脫液將上述原生質(zhì)體洗脫至1.5 mL離心管離心收集，隨后用200 μL儲(chǔ)存液重懸原生質(zhì)體，并加入構(gòu)建的突變盒，置于冰上孵育25 min。最后，在上述孵育物中加入1 mL PEG6000溶液和篩選高滲培養(yǎng)基，經(jīng)37℃培養(yǎng)96 h后，挑取單菌落驗(yàn)證基因敲除情況。

大蠟螟幼蟲(chóng)致病力實(shí)驗(yàn) 選取重量為0.3～0.35 g大蠟螟幼蟲(chóng)進(jìn)行分組，每組16只。使用含有0.01% Tween 20的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液將5×107個(gè)/mL煙曲霉孢子重懸。使用微量注射器將10 μL上述孢子懸液注射入大蠟螟左排最下端腹足。同時(shí)設(shè)置兩個(gè)對(duì)照組，其中一組大蠟螟被注射10 μL含有0.01% Tween 20的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBST)，另一組大蠟螟不做任何處理。注射完成后置于37℃遮光培養(yǎng)，每12 h記錄大蠟螟存活情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism(V 5.01)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，One-way ANOVA比較多組數(shù)據(jù)，P<0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果和分析

2.1 分析煙曲霉Cyp51A和Cyp51B的進(jìn)化關(guān)系

為分析煙曲霉Cyp51A和Cyp51B的進(jìn)化關(guān)系，本研究選取曲霉屬和鐮刀屬真菌的Cyp51A和Cyp51B，以及酵母屬和念珠菌屬真菌的Erg11(作為外支)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。如圖1結(jié)果顯示，雖然煙曲霉Cyp51A和Cyp51B氨基酸序列相似度高達(dá)69.9%，但兩者分別分布于真菌Cyp51A和Cyp51B聚成的兩大分支，并且Cyp51A和Cyp51B與Erg11存在較遠(yuǎn)進(jìn)化距離，提示Cyp51與Erg11親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上結(jié)果提示Cyp51A和Cyp51B分化有可能早于曲霉屬等真菌最近共同祖先的出現(xiàn)。

圖1 根據(jù)Cyp51B、Cyp51A和Erg11氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.1 Phylogenetic analysis of Cyp51B, Cyp51A, and Erg11

2.2 構(gòu)建和驗(yàn)證煙曲霉cyp51A和cyp51B基因敲除菌株

為研究煙曲霉Cyp51A和Cyp51B生物學(xué)功能差異，本研究利用同源重組原理敲除煙曲霉菌株CEA17ΔKu80的cyp51A和cyp51B的編碼基因，原理如下：通過(guò)Overlap PCR技術(shù)構(gòu)建含潮霉素篩選標(biāo)記的突變盒，該突變盒包括靶基因(本研究中為煙曲霉cyp51A或cyp51B)上游同源臂、下游同源臂和潮霉素耐藥基因(見(jiàn)圖2A)；再將該突變盒轉(zhuǎn)化至煙曲霉原生質(zhì)體，該突變盒將有一定幾率原位替換靶基因。如圖2B和2C顯示，本研究成功構(gòu)建了用于煙曲霉cyp51A和cyp51B基因敲除的突變盒，并分別轉(zhuǎn)化至用煙曲霉CEA17ΔKu80制備的原生質(zhì)體中，應(yīng)用潮霉素篩選培養(yǎng)基初篩轉(zhuǎn)化子，再進(jìn)行PCR驗(yàn)證。在成功敲除cyp51A或cyp51B編碼基因的突變株中未檢測(cè)到cyp51A或cyp51B編碼基因的片段(見(jiàn)圖2Ca)，但可檢測(cè)到潮霉素基因片段(見(jiàn)圖2Cb)。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，無(wú)法獲得cyp51A和cyp51B雙基因敲除株，可能是同時(shí)敲除會(huì)導(dǎo)致菌株死亡，提示煙曲霉Cyp51A和Cyp51B在麥角甾醇合成通路中功能具有重疊性。

圖2 利用同源重組原理敲除煙曲霉cyp51A和cyp51B. a中hph指潮霉素耐藥基因，5’ flanking fragment和3’ flanking fragment分別指靶基因上游同源臂和下游同源臂； Ba中泳道1～4分別為Cyp51A編碼基因的上游同源臂、潮霉素耐藥基因和下游同源臂，以及這些片段拼接后的突變盒; Bb中泳道1～4分別為敲除cyp51B編碼基因擴(kuò)增的上游同源臂、潮霉素耐藥基因和下游同源臂，以及這些片段拼接后的突變盒; Ca中泳道1～12是檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中的cyp51A編碼基因，泳道13是陽(yáng)性對(duì)照；泳道14～24是檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中的cyp51B編碼基因，泳道25是陽(yáng)性對(duì)照； Cb中泳道1～6是檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中是否存在潮霉素耐藥基因，泳道7是陽(yáng)性對(duì)照，泳道8是陰性對(duì)照?qǐng)D3 Δcyp51A和Δcyp51B生物學(xué)功能差異性分析. A.檢測(cè)Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)伏立康唑的敏感性，VOR：伏立康唑； B.檢測(cè)Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)溫度的敏感性； C.檢測(cè)Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力Fig.2 Knockout of cyp51A and cyp51B in Aspergillus fumigates by homologous recombination technology. A. hph refers to the hygromycin resistance cassette; 5’ flanking fragment and 3’ flanking fragment refer to the upstream and downstream homology arms of target gene, respectively; Ba. panel 1-4 refer to the upstream homology arm, hygromycin resistance cassette, downstream homology arm, and mutant cassette, respectively, for construction of Δcyp51A mutant; Bb. panel 1-4 refer to the upstream homology arm, hygromycin resistance cassette, downstream homology arm, and mutant cassette, respectively, for construction of Δcyp51B mutant; Ca. cyp51A and cyp51B fragments were detected in the Δcyp51A (panel 1-12) and Δcyp51B (panel 14-24) mutants, respectively; panel 13 and 25 are positive controls; Cb. fragments of the hygromycin resistance cassette were detected in Δcyp51A and Δcyp51B mutants (panel 1-6); panel 7 and 8 refer to the positive and negative controls, respectively Fig.3 Functional analysis of Δcyp51A and Δcyp51B in Aspergillus fumigatus. A. voriconazole susceptibility of the Δcyp51A and Δcyp51B mutants; B. high temperature susceptibility of the Δcyp51A and Δcyp51B mutants; C. virulence characterization of the Δcyp51A and Δcyp51B mutants in the Galleria mellonella infection model

2.3 研究煙曲霉cyp51A和cyp51B生物學(xué)功能差異性

鑒于真菌Cyp51是唑類藥物的靶點(diǎn)，本研究首先檢測(cè)了Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)唑類藥物敏感性。如圖3A顯示，雖然在無(wú)藥時(shí)Δcyp51A、Δcyp51B與WT相比，宏觀菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異，但是Δcyp51A對(duì)0.15 mg/L伏立康唑的耐受水平顯著低于WT和Δcyp51B；而與WT相比，Δcyp51B對(duì)伏立康唑的耐受水平略有下降。本研究還發(fā)現(xiàn)在50℃下Δcyp51B在SDA、PDA和MM上的生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯弱于WT和Δcyp51A，而Δcyp51A與WT的生長(zhǎng)能力無(wú)明顯差異，提示Cyp51B在煙曲霉對(duì)高溫環(huán)境耐受中具有重要作用(見(jiàn)圖3B)。鑒于高溫耐受性是煙曲霉有別于其他曲霉的關(guān)鍵特征，且該能力可能與煙曲霉的致病力有關(guān)，本研究隨后以大蠟螟幼蟲(chóng)模型檢測(cè)了Δcyp51A和Δcyp51B的致病力，結(jié)果顯示，與WT相比，Δcyp51A(P=0.327)和Δcyp51B(P=0.2589)對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，Δcyp51A和Δcyp51B之間的致病力差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.9127)。

3 討 論

Cyp51是保守存在于真菌麥角甾醇合成通路中的關(guān)鍵限速酶，其作為重要的抗真菌藥物靶點(diǎn)長(zhǎng)久以來(lái)得到學(xué)者廣泛關(guān)注[17]?，F(xiàn)已知多種真菌基因組中存在Cyp51旁系同源蛋白，例如指狀青霉(Penicilliumdigitatum)中保守存在Cyp51A和Cyp51B，禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中甚至存在Cyp51A、Cyp51B和Cyp51C 3個(gè)旁系同源蛋白[12]。一般認(rèn)為，這些Cyp51的同源蛋白由基因復(fù)制產(chǎn)生，并在漫長(zhǎng)演化過(guò)程中在種群中固定和擴(kuò)散。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，包括煙曲霉在內(nèi)的真菌Cyp51A和Cyp51B聚成兩個(gè)主要分支，呈現(xiàn)明顯進(jìn)化距離，提示這兩類旁系同源蛋白在曲霉屬等真菌演化時(shí)間較長(zhǎng)，因而生物學(xué)功能可能產(chǎn)生分化。

本研究成功構(gòu)建煙曲霉cyp51A和cyp51B的單個(gè)基因敲除菌株，但無(wú)法獲得上述兩個(gè)基因的雙敲菌株，提示Cyp51A和Cyp51B在煙曲霉麥角甾醇合成通路中均可行使羊毛甾醇催化活性；其他研究也顯示，禾谷鐮刀菌被單獨(dú)敲除cyp51A、cyp51B或cyp51C基因后，其麥角甾醇的含量無(wú)顯著性差異[12]，以上結(jié)果共同說(shuō)明真菌Cyp51同源蛋白在麥角甾醇合成通路中具有功能冗余性。本研究發(fā)現(xiàn)，與WT相比，Δcyp51A和Δcyp51B對(duì)伏立康唑耐受水平下降，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與Cyp51總表達(dá)量下降有關(guān)[18]。此外，Δcyp51A對(duì)伏立康唑耐受的下降程度顯著高于Δcyp51B，暗示伏立康唑?qū)熐笴yp51B的結(jié)合能力可能高于Cyp51A。Andrew等[19]研究中也發(fā)現(xiàn)，體外純化后的煙曲霉Cyp51B結(jié)合伏立康唑能力顯著高于Cyp51A。然而，看似矛盾的是，臨床和環(huán)境中分離到的唑類耐藥煙曲霉往往與自身Cyp51A的氨基酸位點(diǎn)突變有關(guān)[20]。對(duì)此矛盾的一種解釋是，煙曲霉Cyp51B是麥角甾醇合成通路中主要催化酶，對(duì)非同義突變的容錯(cuò)率較低，而Cyp51A則是煙曲霉適應(yīng)環(huán)境條件的可調(diào)控蛋白；因此，當(dāng)唑類藥物優(yōu)先與煙曲霉Cyp51B結(jié)合后，藥物篩選壓力更易導(dǎo)致Cyp51A可彈性的表達(dá)和突變。實(shí)際上，其他研究中發(fā)現(xiàn)cyp51B的編碼基因在煙曲霉中是持續(xù)性表達(dá)，而cyp51A的編碼基因是誘導(dǎo)性表達(dá)，這也從側(cè)面支持了本研究的這一解釋[21]。

與通常的認(rèn)識(shí)不同，本研究首次發(fā)現(xiàn)Cyp51B并非僅是Cyp51A的功能冗余蛋白，而是在漫長(zhǎng)的演化過(guò)程中分化出獨(dú)特的功能。我們發(fā)現(xiàn)Δcyp51B的高溫耐受性在多種培養(yǎng)基中均顯著低于Δcyp51A和WT，顯示Cyp51B可能在煙曲霉適應(yīng)高溫環(huán)境的抗逆性中具有重要作用。煙曲霉的高溫耐受能力是其區(qū)別于其他曲霉的重要鑒定指標(biāo)。有研究顯示，煙曲霉耐熱能力可能與其致病力有關(guān)[22]；此外，煙曲霉的耐熱能力也可能是其在農(nóng)業(yè)堆肥中獲得種群優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而得到播散的重要原因[23]。因此，對(duì)于煙曲霉高溫耐受基因和調(diào)控信號(hào)通路的研究在尋找藥物靶點(diǎn)和防治煙曲霉相關(guān)疾病等領(lǐng)域有重要前景。有趣的是，在其他研究中顯示，釀酒酵母麥角甾醇合成通路中多個(gè)基因的缺失也可顯著改變突變株對(duì)溫度的適應(yīng)能力[24]。這些結(jié)果暗示真菌的麥角甾醇合成通路可能與其溫度敏感性有重要聯(lián)系，但該假設(shè)仍需在鐮刀菌屬等其他真菌中進(jìn)行驗(yàn)證。本研究推測(cè)cyp51B編碼基因的缺失可能通過(guò)影響煙曲霉麥角甾醇合成通路中間代謝產(chǎn)物含量，進(jìn)而改變了煙曲霉對(duì)高溫的適應(yīng)能力。另一種可能是，煙曲霉Cyp51A與Cyp51B相比，其酶活性在高溫下降低，進(jìn)而干擾了麥角甾醇合成通路，造成煙曲霉生長(zhǎng)減弱。此外，雖然前人認(rèn)為真菌的耐熱能力可能與其致病力有關(guān)[23,25]，但本研究在大蠟螟幼蟲(chóng)致病力模型中未發(fā)現(xiàn)Δcyp51B與Δcyp51A和WT相比在致病力上有顯著區(qū)別，因此煙曲霉高溫耐受性與其致病力的聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，雖然煙曲霉Cyp51A和Cyp51B在麥角甾醇合成通路功能具有冗余性，但煙曲霉Cyp51A與Cyp51B具有明顯的進(jìn)化距離，提示在漫長(zhǎng)演化過(guò)程中兩種蛋白功能已分化。此外，Cyp51A和Cyp51B在煙曲霉對(duì)唑類藥物耐受性和高溫耐受性等方面均有功能差異性。