李明洋，SAIDU Kamara，汪琪，郭艷茹，李青峰，朱珊麗，陳俊，蔣朋飛，張麗芳

溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所 病原生物與免疫學(xué)系，浙江 溫州 325035

新型冠狀病毒?。╟orona virus disease 2019，COVID-19）暴發(fā)，嚴(yán)重影響了公眾的生活秩序和生命安全。目前認(rèn)為新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）為COVID-19的病原體，與SARS-CoV是姊妹病毒[1]。SARS-CoV-2是目前已知第7種可以感染人的冠狀病毒（coronavirus，CoV），其基因組為線性單股正鏈RNA，可編碼刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）、核衣殼蛋白（N）等結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其中，E蛋白結(jié)構(gòu)最小，僅由約80個氨基酸殘基組成，分布于CoV的包膜表面，可與M蛋白共同誘導(dǎo)CoV的病毒樣顆粒形成，在病毒裝配、出芽、包膜形成中發(fā)揮著重要作用，若CoV E蛋白缺失，則影響病毒的成熟、增殖，導(dǎo)致子代病毒毒力下降[3]。因此，E蛋白也成為CoV疫苗研究的候選靶抗原之一。本研究基于SARS-COV-2 E蛋白的氨基酸序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測和分析E蛋白結(jié)構(gòu)及免疫優(yōu)勢表位，為SARS-CoV-2藥物篩選和疫苗研制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 SARS-CoV-2 E蛋白氨基酸序列及理化性質(zhì) 從美國國家生物技術(shù)信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取SARS-CoV-2 E蛋白的氨基酸序列（QHD43418.1），并通過EXPASY服務(wù)器（https://www.expasy.org/tools）上的ProtParam軟件分析預(yù)測其理化性質(zhì)。

1.2 SARS-CoV-2 E蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 分別應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的SOPMA、GOR等方法，分析預(yù)測SARS-CoV-2 E蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.3 SARS-CoV-2 E蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測 分別應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)的TMHMM、Phobius軟件，同時預(yù)測SARS-CoV-2 E蛋白跨膜區(qū)域。

1.4 SARS-CoV-2 E蛋白B細(xì)胞表位綜合分析 應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）軟件對SARS-CoV-2 E蛋白的Hopp & Woods親水性系數(shù)、Emini表面可及參數(shù)、Jameson-Wolf抗原性、Zimmerman極性參數(shù)、柔韌性參數(shù)和線性表位預(yù)測。結(jié)合各預(yù)測參數(shù)并用吳玉章等[4]建立的抗原性指數(shù)（antigenicity index，AI）綜合分析其B細(xì)胞優(yōu)勢表位。

1.5 SARS-CoV-2 E蛋白CTL表位綜合分析 應(yīng)用Net CTL（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）、SYFPEITHI、 （http://www.syfp-eithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）、IEDB（http://tools.immuneepitope.org/main/）軟件針對HLA-A*02:01、HLA-A*24:02（human leukocyte antigen，HLA，是由HLA基因復(fù)合體所編碼的產(chǎn)物，存在于所有有核細(xì)胞的膜上，是組織排斥反應(yīng)的主要抗原）及H2-Kd（histocompatibility-2，H2，H-2I類相當(dāng)于人類HLA的A基因，與移植物排斥反應(yīng)同樣相關(guān)）類分子預(yù)測E蛋白的CTL限制性表位。結(jié)合3個預(yù)測軟件對CTL表位結(jié)果做進(jìn)一步分析。

1.6 SARS-CoV-2 E蛋白免疫優(yōu)勢表位和同源性分析 綜合上述預(yù)測的B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位，選出同時含有多個T或B細(xì)胞表位的肽段作為免疫優(yōu)勢表位。應(yīng)用Vector NTI對已知感染人類的CoV屬E蛋白序列及其免疫優(yōu)勢表位進(jìn)行同源性比對。

1.7 SARS-CoV-2 E蛋白三級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域分析 運(yùn)用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)EXPASY網(wǎng)站上Swiss Model工具在線分析SARS-CoV-2 E蛋白三級結(jié)構(gòu)并建模，并對該蛋白功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 E蛋白的氨基酸序列和理化性質(zhì)SARS-CoV-2 E蛋白由75個氨基酸組成，其氨基酸序列為：MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTA LRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV。ProtParam分析顯示該蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為8.37 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為8.57，可推測分子式為C390H625N91O103S4，不穩(wěn)定性指數(shù)（instability index，II，II＞40 為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)）為38.68，結(jié)果表明該蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。親水性平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）為1.128，通常GRAVY分布在-2～2，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越大表示親水性越強(qiáng)，而兩性氨基酸多處于-0.5～0.5；該蛋白質(zhì)包含較高占比的疏水氨基酸，包括18.7%的亮氨酸（Leu）和17.3%的纈氨酸（Val），綜合預(yù)測結(jié)果表明該蛋白質(zhì)為疏水性蛋白。

2.2 SARS-CoV-2 E蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的GOR、SOMPA預(yù)測SARS-CoV-2 E蛋白的二級結(jié)構(gòu)。GOR顯示其二級結(jié)構(gòu)由33.33% α螺旋（Alpha helix，Hh）、13.33% β片層（Extended strand，Ee）、53.33%無規(guī)卷曲（Random coil，Cc）構(gòu)成；SOPMA顯示其二級結(jié)構(gòu)由44% α螺旋、26.67%β片層、20%無規(guī)卷曲、9.33% β轉(zhuǎn)角（Beta turn，Tt）構(gòu)成。綜合預(yù)測E蛋白主要由α螺旋為主，共同序列出現(xiàn)在15-39，少見β轉(zhuǎn)角。無規(guī)卷曲序列為：52-54，63-66，69-71，見圖1。

2.3 SARS-CoV-2 E蛋白跨膜區(qū)域的預(yù)測 應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)的TMHMM、Phobius預(yù)測SARS-CoV-2 E蛋白，結(jié)果顯示SARS-CoV-2 E蛋白為跨膜蛋白。TMHMM軟件預(yù)測氨基酸序列1-11為膜外區(qū)域，12-34為跨膜區(qū)域，35-75為膜內(nèi)區(qū)域，見圖2A；Phobius軟件預(yù)測氨基酸序列1-11為膜內(nèi)區(qū)域，12-37為跨膜區(qū)域，38-75為膜外區(qū)域，見圖2B。綜合跨膜預(yù)測軟件，預(yù)測E蛋白跨膜區(qū)域?yàn)?2-34，且為α螺旋，其序列為LIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAIL，N端位于膜內(nèi)，C端位于膜外，見圖2C。

圖1 SARS CoV-2 E蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 SARS-CoV-2 E蛋白B細(xì)胞表位的預(yù)測分析 應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的ProtScale軟件對Hopp &Woods親水性系數(shù)、Emini表面可及參數(shù)、Jameson-Wolf抗原性參數(shù)、Zimmerman極性參數(shù)、柔韌性參數(shù)和線性表位預(yù)測。提示其B細(xì)胞表位區(qū)域最可能為SEETGT（6-11），平均AI為0.018；KNLNSSRV（63-70），平均AI為0.036，見圖3和表1。

圖3 SARS-CoV-2 E蛋白不同參數(shù)預(yù)測結(jié)果

表1 應(yīng)用不同方法預(yù)測SARS-CoV-2 E蛋白表位的肽段位置

2.5 SARS-CoV-2 E蛋白限制性CTL表位預(yù)測結(jié)果NetCTL 1.2 Server預(yù)測數(shù)值中包括HLA-I分子的親和力分值（affinity，aff）、親和力分值重置值（affinity rescale，aff-rescale）、羧基端酶切效率（C-terminal cleavage，cle）、抗原處理相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)效率（transporter-associated antigen processing，tap）和綜合分?jǐn)?shù)（combined score，COMB）。根據(jù)COMB值越大，特異性越高的特性，選擇閾值為COMB＞1.0且aff＞0.5的九肽作為候選表位。HLA-A2限制性CTL表位5個，HLA-A24限制性CTL表位1個，見表2。其中人源HLA-A24限制性CTL表位與鼠源H2-Kd限制性CTL表位序列一致，對Net CTL的初步預(yù)測結(jié)果再用SYFPEITHI、IEDB做進(jìn)一步的分析。篩選出的HLA-A2和HLA-A24限制性CTL表位均具有較高的親和力（SYFPEITHI分值＞20）；IEDB采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測，IC50＜50 nmol/L被認(rèn)為是高親和力，且數(shù)值越低親和力越高[5]。因HLA-A24型/H2-Kd型限制性CTL表位的IEDB預(yù)測結(jié)果為低親和肽段，僅能參考SYFPEITHI分?jǐn)?shù)，故放在最后。選擇SYFPEITHI/IEDB值分?jǐn)?shù)較高的限制性表位肽用于下一步研究。

表2 SYFPEITHI、IEDB軟件預(yù)測SARS-CoV-2 E蛋白CTL天然表位得分表

2.6 SARS-CoV-2 E蛋白的免疫優(yōu)勢表位和同源性分析 根據(jù)上述預(yù)測結(jié)果最終選擇具有多個CTL表位的氨基酸區(qū)域P1（16-34aa）和同時具有B細(xì)胞表位和CTL表位的氨基酸區(qū)域P2（50-70aa）作為免疫優(yōu)勢表位，見圖4A。通過Vector NTI軟件對α、β、γ和δ屬冠狀病毒E蛋白與SARS-CoV-2 E蛋白序列進(jìn)行同源性比對，SARS-CoV-2 P1免疫優(yōu)勢表位與Bat-SARS-like-CoV和SARS-CoV序列完全一致（100%）；P2免疫優(yōu)勢表位與Bat-SARS-like-CoV的序列仍然完全一致（100%），與SARS-CoV序列也表現(xiàn)出高相似度（86%）；而與其他種屬冠狀蛋白的相似性較低（10%～38%），見圖4B。系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果顯示，SARS-CoV-2、SARS-CoV和Bat-SARS-like-CoV位于同一分支，表明其具有更接近的同源關(guān)系，而其他CoV如MERS與SARS-CoV-2雖具有平行關(guān)系，但分支相隔較遠(yuǎn)，物種進(jìn)化分歧時間更長，親緣關(guān)系更差，見圖4C。

2.7 SARS-CoV-2 E蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域 運(yùn)用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)網(wǎng)站Swiss Model在線分析E蛋白三級結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域，免疫優(yōu)勢表位P1和P2標(biāo)記三維結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域圖中，見圖5A。紅色為P1區(qū)段（16-34）SVLLFLAFVVFLLVTLAIL；藍(lán)色為P2區(qū)段（50-70）SLVKPSFYVYSRVKNLNSSRV。此外，經(jīng)NCBI中（conserved domain database，CCD）預(yù)測該蛋白中N端（12-34）為跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembranedomains，TMD），介導(dǎo)物質(zhì)運(yùn)輸及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能；C端（72-75）為PDZ結(jié)合序列（PDZ-bing motif，PBM），與病毒穩(wěn)定性有關(guān)，見圖5B。

圖4 SARS CoV-2 E蛋白的免疫優(yōu)勢表位和同源性分析

圖5 SARS-CoV-2 E蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能區(qū)域

3 討論

E蛋白對CoV的感染與致病具有重要意義，作為其孔蛋白（viroporin），可在宿主細(xì)胞膜上形成選擇性離子通道，介導(dǎo)特殊離子（如Na+、K+、Ca2+、Cl-、H+）運(yùn)輸，從而對病毒的感染復(fù)制和增殖等功能產(chǎn)生影響；這不僅有助于闡明SARS-CoV-2高致病性的機(jī)制，同時離子通道還可作為一個藥物作用的潛在靶點(diǎn)，是抗病毒藥物設(shè)計的靶點(diǎn)之一[3]。本研究通過信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2（Wuhan-Hu-1株）與SARS-CoV（BJ01株）兩個原型株E蛋白僅有4個氨基酸殘基的差別，相似性為94.74%。因此，基于SARS-CoV E蛋白的藥物研發(fā)可能適用于SARS-CoV-2。

SARS-CoV E蛋白是由76 個氨基酸組成的II型膜蛋白，其功能結(jié)構(gòu)域主要分布于氨基酸的N端和C端。其N端12-34aa區(qū)段為疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域TMD，該區(qū)段主要由亮氨酸和纈氨酸組成，可提供強(qiáng)大的疏水特性，以保證蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；同時E蛋白同源寡聚化可形成離子通道，其氨基酸序列的Asn 15和Val 25是決定該離子通道活性的關(guān)鍵氨基酸殘基，當(dāng)離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+時，可觸發(fā)并激活炎癥小體，進(jìn)一步誘發(fā)炎性肺損傷[6-7]。而E蛋白的C末端包含一個以β-coil-β為基元的保守脯氨酸殘基，該基序可能起高爾基體復(fù)合物靶向信號的作用，有助于E蛋白的定位并影響病毒的增殖周期[8]；C端的最后四個氨基酸殘基（DLLV）為PBM，影響著病毒穩(wěn)定性和毒力[9-10]。本研究結(jié)果顯示，SARS-CoV-2和SARS-CoV E蛋白空間結(jié)構(gòu)幾乎一致，且TMD和PBM區(qū)域序列完全一致（100%）。表明SARS-CoV-2 E蛋白與SARS-CoV具有同樣的功能。

研究表明，缺失E蛋白可抑制MERS-CoV病毒顆粒的成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，降低SARS-CoV病毒顆粒的滴度，而以缺失E蛋白和突變羧基端制造的減毒活疫苗，在動物實(shí)驗(yàn)中已初步取得療效。SARS-CoV-ΔE（缺失E蛋白）感染的小鼠肺部，與其相關(guān)的大量促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平降低，而在mRNA和蛋白質(zhì)水平上，抗炎細(xì)胞因子的水平均升高[11]，表明減毒病毒可以導(dǎo)致肺部炎癥的減輕以及更強(qiáng)的抗病毒T細(xì)胞反應(yīng)，保護(hù)小鼠免受致命病毒的攻擊。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)E蛋白缺失，SARS-CoV輔助蛋白3a和8a表現(xiàn)出相對補(bǔ)償功能，存在毒力恢復(fù)的可能[3]。因此，減毒活疫苗仍然存在不足，提示疫苗研究需要從新的角度考慮。免疫優(yōu)勢表位研究一直是疫苗的前沿研究。由多個B細(xì)胞表位或CTL表位組成的免疫優(yōu)勢表位，既可以通過產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫，達(dá)到清除病毒的目的，又可以通過產(chǎn)生的特異性抗體，預(yù)防病毒感染和復(fù)發(fā)。本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)獲得2個SARS-CoV-2 E蛋白的免疫優(yōu)勢表位，位于其N端16-34aa和C端50-70aa區(qū)段，與α、β、γ和δ屬冠狀病毒序列比對，發(fā)現(xiàn)具有較高的同源性，表明免疫優(yōu)勢表位在一定程度上可同時識別其他CoV感染的細(xì)胞，如SARS-CoV。本研究可為基于SARS-CoV-2 E蛋白的發(fā)病機(jī)制及特異性預(yù)治療疫苗研究提供理論基礎(chǔ)。