構(gòu)建誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)用于小鼠免疫細(xì)胞基因功能研究

趙艷娜，邱 榮，沈 南，唐元家

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕病科，上海市風(fēng)濕病學(xué)研究所，上海200127；2.中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所，上海200031

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）組成的CRISPR/Cas 系統(tǒng)最早是在古細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中形成的RNA 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，能夠抵御病毒及外源DNA 的入侵［1］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型［2-3］，Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)識(shí)別和切割核酸序列需要大型的多Cas蛋白復(fù)合物［4］，而Ⅱ型系統(tǒng)只需要Cas9 核酸酶和單鏈導(dǎo)向RNA（single guide RNA，sgRNA）即可。在該系統(tǒng)中，Cas9核酸酶在sgRNA 的指導(dǎo)下對(duì)靶基因組DNA 進(jìn)行切割并引起DNA雙鏈斷裂［5-6］。細(xì)胞通過(guò)非同源末端修復(fù)或同源重組修復(fù)雙鏈斷裂，修復(fù)過(guò)程中會(huì)引起DNA 片段的插入、缺失或替換，從而造成移碼框突變，達(dá)到基因敲除的目的［7］。

目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用到動(dòng)物模型建立、哺乳動(dòng)物發(fā)育研究中［8］。特別是近些年Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠的出現(xiàn)解決了Cas9 遞送的問(wèn)題，極大地拓展了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用［9-10］。但是，大多數(shù)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中Cas9 和sgRNA 通常持續(xù)表達(dá)［11］。這往往會(huì)引起基因組DNA 過(guò)度切割，從而增加脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)［12-13］。此外，一些關(guān)鍵基因敲除可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)育缺陷甚至胚胎致死。因此，為了研究這些基因的功能，往往需要構(gòu)建條件敲除小鼠或者誘導(dǎo)型基因敲除小鼠，實(shí)現(xiàn)特定發(fā)育階段或者特定時(shí)間點(diǎn)基因敲除?，F(xiàn)在逐漸發(fā)展起來(lái)的可誘導(dǎo)性基因敲除技術(shù)通過(guò)誘導(dǎo)性表達(dá)Cas9或者sgRNA 來(lái)實(shí)現(xiàn)基因誘導(dǎo)型敲除，似乎能夠有效克服上述局限性［14-15］。

四環(huán)素（tetracycline，Tet）誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)由于具有高效性、精確性、可控性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因功能研究，例如基因過(guò)表達(dá)、基因干擾等［16-17］。其基本原理是通過(guò)加入誘導(dǎo)藥物Tet 或強(qiáng)力霉素（Dox）改變調(diào)控蛋白的構(gòu)象，從而調(diào)控目的基因的表達(dá)。在本研究中，通過(guò)構(gòu)建Dox 誘導(dǎo)型sgRNA 表達(dá)載體和Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠，建立誘導(dǎo)型CRISPR 系統(tǒng)，可通過(guò)體外或體內(nèi)添加Dox 誘導(dǎo)sgRNA 表達(dá)，實(shí)現(xiàn)基因誘導(dǎo)性敲除，以期為小鼠免疫細(xì)胞內(nèi)基因功能研究提供一個(gè)高效、簡(jiǎn)單、可控的基因編輯工具。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、SPF級(jí)Rosa26-LSL-Cas9（024857）小鼠和B6.FVB-Tg（EIIa-cre）C5379Lmgd/J（003724）小鼠20只，均購(gòu)于美國(guó)The Jackson Laboratory。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6～8周齡雄性小鼠，體質(zhì)量20～25 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)在中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院SPF級(jí)動(dòng)物房［動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2019-0001］，飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，空氣相對(duì)濕度40%～60%。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)201903H486）。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶Bbs1、同源重組酶NEBuider HiFi DNA Assembly Master Mix 和T7 核酸內(nèi)切酶Ⅰ（T7 endonuclease Ⅰ，T7EⅠ）（NEB，美國(guó)），Lipo2000（ThermoFisher，美國(guó)），小鼠骨髓譜系發(fā)育陰性細(xì)胞分離試劑盒（美天旎，德國(guó)），抗小鼠F4/80 PE 標(biāo)記抗體BM8（Biolegend，美國(guó)），細(xì)胞培養(yǎng)基IMDM、無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰酶（Gibco，美國(guó)），細(xì)胞因子促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、干細(xì)胞因子1（stem cell factor 1， SCF1）、 白 介 素-6 （interleukin-6， IL-6） 和IL-3（R&D，美國(guó)），Plat-E 細(xì)胞和L929細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本），熒光顯微鏡（ZEISS，德國(guó)）， Centrifuge 5417R 低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），DNA Thermal Cycler 9700 PCR 儀（Thermo Scientific，美國(guó)），CytoFLEX LX 流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)型sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 限制性內(nèi)切 酶Xho1 和Sal1 雙 酶 切LMP （ MSCV-LTR-miR30-PIG） 載體，切膠回收大片段獲得反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架?；蚝铣蒛6-TetO-sgRNA 和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR 片段（蘇州金唯智生物科技有限公司）。利用同源重組將2個(gè)片段組裝進(jìn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、挑克隆、測(cè)序，獲得正確載體。

1.2.2 sgRNA 設(shè)計(jì) 使用MIT CRISPR 設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)sgRNA （http：//crisp.mit.edu）。F4/80 sgRNA 序列： 5'-ACCCAAGATCCATTACAATG-3'。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝和細(xì)胞系感染 反轉(zhuǎn)錄病毒由質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Plat-E 包裝細(xì)胞產(chǎn)生，按照Lipo2000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系：20 μg 質(zhì)粒DNA 加入到500 μL Opti-MEM 中稀釋DNA（溶液A）混勻；40 μL Lipo2000 加入到500 μL Opti-MEM（溶液B）混勻；將溶液A 和B 混合混勻，室溫靜置15 min 后加入培養(yǎng)皿。4 h 后換液，48 h收集病毒上清液。反轉(zhuǎn)錄感染NIH3T3 細(xì)胞系，需提前1 d將細(xì)胞接種于96孔板，次日待細(xì)胞匯合度達(dá)到30%時(shí)即可進(jìn)行病毒感染，感染48 h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒感染效率。

1.2.4 小鼠骨髓造血干細(xì)胞的分離 頸椎脫臼法處死小鼠取其骨髓細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用Miltenyi MACS免疫磁珠譜系陰性分選試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的方法富集小鼠骨髓譜系發(fā)育陰性細(xì)胞（Lineage negative cell，Lin-）。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓造血干細(xì)胞 小鼠Lin-細(xì)胞培養(yǎng)基為IMDM，含10%FBS 并加入細(xì)胞因子（TPO 50 ng/mL、SCF1 50 ng/mL、IL-6 50 ng/mL 和IL-3 10 ng/mL）。細(xì)胞激活48 h 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒感染，收集病毒懸液加入6 μg/mL聚凝胺混勻，然后使用該病毒混合液重懸造血干細(xì)胞，1 000×g，32 ℃離心90 min。離心結(jié)束后，吸去病毒上清液，補(bǔ)加2 mL 含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。病毒感染48 h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藍(lán)色熒光蛋白（blue fluorescent protein，BFP）陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.2.6 小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)和Dox 誘導(dǎo)sgRNA表達(dá) 為了驗(yàn)證誘導(dǎo)型CRISPR系統(tǒng)是否可以實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)性基因敲除，選擇巨噬細(xì)胞的表面分子F4/80 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分離Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞，用含10%L929上清培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，誘導(dǎo)其向巨噬細(xì)胞分化。第2日分別感染NC-sgRNA 和F4/80-sgRNA 病毒。第3 日，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入Dox 誘導(dǎo)sgRNA 表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分為NC Dox-、NC Dox+、F4/80 Dox-和F4/80 Dox+共4 組，并加入Puromycin 篩殺未感染的細(xì)胞。第7日，收集細(xì)胞進(jìn)行F4/80抗體染色，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)F4/80陽(yáng)性細(xì)胞比例。1.2.7 T7EⅠ檢測(cè)基因組DNA 切割效率 使用細(xì)胞抽提基因組DNA 試劑盒提取基因組DNA，利用Pusion聚合酶PCR擴(kuò)增F4/80 sgRNA靶位點(diǎn)或預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)周?chē)幕蚪M區(qū)域。F4/80 sgRNA-F：5′-AACGCTTGGGTTTTAT TCGTAGC-3′；F4/80 sgRNA-R：5′-CTTAAGGCCGACT ACGTGCTG-3′。PCR 擴(kuò)增待檢測(cè)DNA 片段，PCR 產(chǎn)物電泳后切膠回收目的條帶。將純化PCR產(chǎn)物與Buffer 2混合進(jìn)行梯度退火。結(jié)束后加入T7EⅠ，并將混合物在37 ℃下孵育1 h。最后加入0.25 mol/L 乙二胺四乙酸以終止反應(yīng)，產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠電泳。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)及分析 使用CytoFLEX LX 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BFP 和F4/80 表達(dá)。使用FlowJo 軟件（Becton Dickinson）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 5 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)比較采用非配對(duì)t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建Dox誘導(dǎo)型sgRNA表達(dá)載體

為了建立藥物誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)基因誘導(dǎo)性敲除，構(gòu)建Dox 誘導(dǎo)型sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。該病毒載體主要由U6-TetO-sgRNA 和EF1α-T2APuro-BFP-T2A-TetR 組成（圖1A）。當(dāng)系統(tǒng)中不存在Dox情況下，Tet 阻遏物（TetR） 結(jié)合在Tet 操縱子位點(diǎn)（TetO）上，嚴(yán)格抑制U6啟動(dòng)子活性，阻遏sgRNA 表達(dá)。當(dāng)加入Dox 后，可解除TetR 對(duì)TetO 的抑制，快速有效地啟動(dòng)該啟動(dòng)子活性，誘導(dǎo)sgRNA 的表達(dá)，Cas9 和sgRNA結(jié)合后可進(jìn)行基因編輯，從而實(shí)現(xiàn)基因可誘導(dǎo)性敲除（圖1B）。

圖1 Dox誘導(dǎo)型sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建策略Fig 1 Construction strategy of Dox-inducible sgRNA retroviral vector

2.2 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝和NIH3T3 細(xì)胞感染

為了驗(yàn)證反轉(zhuǎn)錄病毒載體是否構(gòu)建成功并能夠產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，進(jìn)行病毒包裝和細(xì)胞感染。本研究采用Plat-E細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，只需要轉(zhuǎn)染病毒載體質(zhì)粒即可產(chǎn)生表達(dá)特定sgRNA的反轉(zhuǎn)錄病毒。轉(zhuǎn)染24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)正常（圖2A）。轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到BFP正常表達(dá)（圖2B）。為了驗(yàn)證是否可產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒，收集48 h病毒上清液，感染NIH3T3細(xì)胞。感染48 h后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BFP陽(yáng)性細(xì)胞比例，結(jié)果顯示BFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例高達(dá)50%（圖2C）。以上結(jié)果說(shuō)明Dox誘導(dǎo)型sgRNA反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，并且可以產(chǎn)生具有感染性的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。

2.3 Dox誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中F4/80基因敲除

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：在NC Dox-、NC Dox+和F4/80 Dox-組中，幾乎沒(méi)有F4/80 陰性群體；而在F4/80 Dox+組中，F(xiàn)4/80 陰性群體比例高達(dá)50%（圖3A）。對(duì)4組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果（圖3B）顯示：F4/80 Dox+組F4/80 陰性細(xì)胞比例與其余3 組比較顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。以上結(jié)果顯示，誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因誘導(dǎo)性敲除，其發(fā)揮作用嚴(yán)格依賴(lài)Dox。

圖2 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝和NIH3T3細(xì)胞感染Fig 2 Retrovirus packaging and NIH3T3 cell infection

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞中F4/80 表達(dá)Fig 3 Flow cytometry detection of F4/ 80 expression in bone marrow-derived macrophage

2.4 T7EⅠ實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因組DNA編輯效率

為了驗(yàn)證F4/80基因組DNA是否發(fā)生突變，抽提編輯后細(xì)胞基因組DNA。圍繞F4/80-sgRNA靶向位置上下游設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行后續(xù)T7EⅠ實(shí)驗(yàn)。T7EⅠ實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在F4/80 Dox-組中，T7EⅠ實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物是完整的，未發(fā)生切割；與之相反，在F4/80 Dox+組中，T7EⅠ實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物被切割為約250 bp和230 bp的2條帶，大小符合預(yù)期（圖4）。以上結(jié)果顯示，誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因誘導(dǎo)性敲除，其發(fā)揮作用嚴(yán)格依賴(lài)Dox。

圖4 T7EⅠ實(shí)驗(yàn)檢測(cè)F4/80基因組DNA編輯效率Fig 4 Detect DNA mutations of F4/80 locus by T7EⅠ

2.5 反轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓造血干細(xì)胞

利用免疫磁珠分選試劑盒分離小鼠骨髓造血干細(xì)胞，激活48 h 后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒感染。流式結(jié)果顯示，病毒感染初始2 組BFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例為25%左右，加入Puromycin 進(jìn)行藥物篩選后，BFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例接近100%（圖5）。以上結(jié)果顯示，利用反轉(zhuǎn)錄病毒可以成功感染小鼠骨髓造血干細(xì)胞。

圖5 反轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓造血干細(xì)胞Fig 5 Retrovirus infection of mouse hematopoietic stem cells

3 討論

近些年發(fā)展起來(lái)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠以高效、特異、準(zhǔn)確的方式實(shí)現(xiàn)基因組編輯。除了利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究單個(gè)基因功能外，CRISPR高通量篩選在發(fā)現(xiàn)多種生物學(xué)過(guò)程表型調(diào)節(jié)分子中也發(fā)揮著重要的作用，例如耐藥性、基因表達(dá)、代謝和病毒感染的必需因子。但是，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)基因功能研究時(shí)仍然存在一些局限性。例如，體內(nèi)進(jìn)行造血干細(xì)胞功能研究時(shí)，當(dāng)基因功能對(duì)細(xì)胞存活必不可少時(shí)，將難以產(chǎn)生可利用的細(xì)胞。本研究通過(guò)構(gòu)建Dox 誘導(dǎo)型sgRNA 表達(dá)載體結(jié)合Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠，建立了誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，可以通過(guò)添加Dox 誘導(dǎo)sgRNA表達(dá)，從而在Cas9小鼠細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)性基因敲除，為小鼠免疫細(xì)胞基因功能研究提供了可控的工具。

之前也有大量研究嘗試建立一種可誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，如有研究［18］開(kāi)發(fā)了一種可用光激活的CRISPR/Cas9系統(tǒng)；但是，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都沒(méi)有專(zhuān)用的照明設(shè)備用于活化Cas9 蛋白。此外，一些研究嘗試將Cas9基因置于Tet 響應(yīng)元件啟動(dòng)子控制下，但后來(lái)被證明有Cas9泄漏表達(dá)，從而引起大量不受控制的基因敲除［19-20］。另有一項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了一種Dox 誘導(dǎo)型gRNA（gRNAi）AAV 載體［21］，該載體包括H1/TetO 啟動(dòng)子和持續(xù)表達(dá)TetR等結(jié)構(gòu)。此外，該研究發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度的H1/TetO啟動(dòng)子和U6/TetO啟動(dòng)子可以通過(guò)Dox依賴(lài)方式實(shí)現(xiàn)相似基因組編輯效果。該研究成功運(yùn)用該gRNAi 載體在小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)可控的基因組DNA 編輯。在這個(gè)系統(tǒng)中，只需要向動(dòng)物喂食1 d 含Dox 食物即可誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生基因組編輯，證明誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在體內(nèi)基因功能研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

造血干細(xì)胞具有自我更新能力和增殖能力，可以分化成為紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等各個(gè)類(lèi)型細(xì)胞；作為血液系統(tǒng)中的“始祖細(xì)胞”，被廣泛應(yīng)用于血液、免疫和腫瘤等疾病的治療。因此，開(kāi)發(fā)一種可以高效研究造血干細(xì)胞功能的工具至關(guān)重要。有研究開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9的體內(nèi)篩選系統(tǒng)［22］。該研究利用慢病毒載體系統(tǒng)感染Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓造血干細(xì)胞并移植到免疫缺陷小鼠中，可以在先天免疫細(xì)胞和后天免疫細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因敲除。但是，該系統(tǒng)可能存在一定缺陷，如果目的基因?qū)τ诩?xì)胞發(fā)育存活是必需的，將無(wú)法得到特定發(fā)育階段的細(xì)胞，更無(wú)法研究該基因敲除后對(duì)細(xì)胞功能的影響。而本研究構(gòu)建的藥物誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可通過(guò)Dox依賴(lài)方式在特定發(fā)育階段敲除目的基因，或許可以解決這一難題。

綜上所述，在本研究中，通過(guò)構(gòu)建Dox誘導(dǎo)型sgRNA表達(dá)載體和Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠，建立了誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)成功在小鼠骨髓誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)F4/80 基因可誘導(dǎo)性敲除。此外，本研究利用該載體產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒成功感染小鼠骨髓造血干細(xì)胞，為將來(lái)在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因可誘導(dǎo)性敲除提供了可能。