酪氨酸羥化酶缺乏癥導(dǎo)致多巴反應(yīng)性肌張力不全患兒臨床及遺傳特點

朱海霞，李小晶，梁惠慈，吳汶霖，侯 池，陳連鳳，田 楊，陳文雄

（廣州市婦女兒童醫(yī)療中心神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州 520120）

多巴反應(yīng)性肌張力不全（dopa-responsive dystonia，DRD）是一種罕見的常染色體遺傳運動障礙，最初被Segawa 報道［1］。其典型的表現(xiàn)為兒童或青少年發(fā)病，癥狀可有晝夜波動，低劑量左旋多巴治療可產(chǎn)生戲劇性和持續(xù)性的效果。該病的患病率為0.5～1/百萬［2］。DRD的主要原因是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的缺乏。DRD 涉及的基因包括GCH1、TH、PTS、SPR、QDPR和PCBD［3］。其中，TH基因的缺陷導(dǎo)致酪氨酸羥化酶缺乏癥（tyrosine hydroxylase deficiency，THD），在這種情況下，酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴胺的過程被阻斷，從而導(dǎo)致多巴胺的生成減少，患兒出現(xiàn)DRD 的臨床癥狀。大多數(shù)THD 采用左旋多巴治療，效果明顯，但由于THD 發(fā)病率低，臨床醫(yī)生對其認識程度不足，容易誤診。因此，我們總結(jié)4 個家系，6 例THD 患兒的臨床特征、治療方案、基因檢測結(jié)果和隨訪，以探討THD 患兒臨床表型與基因突變的相關(guān)性，提高臨床醫(yī)生對THD 的認識，以促進早期干預(yù)，改善患兒預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集

收集2017年6月至2020年11月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心小兒神經(jīng)內(nèi)科首次確診的6 例THD患兒。本研究納入4 個非親緣的中國血統(tǒng)家系，共6 例患兒?；純涸\斷符合THD 的診斷標準或遺傳標準［4］。臨床標準是指左旋多巴治療后肌張力障礙改善至少50%的患兒。遺傳標準是指基因分析顯示TH基因突變的患兒。

1.2 臨床資料收集

收集患兒臨床資料，包括家族史、性別、發(fā)病年齡、診斷年齡、肌張力障礙的臨床表現(xiàn)、發(fā)病時附加特征、晝夜波動、神經(jīng)體征、實驗室檢查（肝腎功能、銅藍蛋白、血乳酸、血氨、血漿氨基酸、?；鈮A、尿有機酸、甲狀腺功能）、頭顱磁共振成像及神經(jīng)生理測試（腦電圖，腦干聽覺和視覺誘發(fā)電位）、治療及預(yù)后。末次隨訪時間為2020年11月。所有患兒都接受了一系列神經(jīng)學(xué)檢查和發(fā)育里程碑評估。末次隨訪，采用韋氏兒童智力量表，通過智力商數(shù)測驗，對患兒認知功能進行評分。

1.3 基因分析

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（穗婦兒科倫批字［2019］第40101 號），并經(jīng)監(jiān)護人知情同意。取患兒及其父母外周血各4 mL。以鹽析法獲得基因組DNA，采用全外顯子二代測序方法進行遺傳學(xué)分析，使用Illumina Nextseq 500 測序平臺進行測序，測序平均覆蓋深度為200×左右，＞10×覆蓋區(qū)間占100%，＞20×覆蓋區(qū)間占100%，并對檢測結(jié)果進行Sanger 一代驗證。應(yīng)用預(yù)測軟件對變異的保守性、致病性、危害性進行預(yù)測。參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會變異分類指南，對變異進行分類。檢索HGMD、PubMed、Clinvar 等數(shù)據(jù)庫，檢索相關(guān)文獻，分析文獻內(nèi)容。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)輸入SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，建立數(shù)據(jù)庫，進行統(tǒng)計學(xué)描述。計數(shù)資料以例數(shù)表示，計量資料以中位數(shù)（范圍）表示。

2 結(jié)果

2.1 6例THD患兒的臨床表現(xiàn)

本研究6 例THD 患兒發(fā)病的中位數(shù)年齡為11.5 個月（范圍從3 個月到4 歲）。6 例患兒，男4例，女2 例，男女患兒比例為2：1。6 例患兒均否認家族遺傳病史。6 例患兒均存在肌力下降及肌張力異常，運動發(fā)育遲緩，2 例面具臉，3 例流涎，2 例晨輕暮重表現(xiàn)，其中患兒#3（弟弟）及#4（姐姐）來自同一家庭，既往外院診斷為“遺傳性痙攣性截癱”，#3 患兒1 歲會爬，2 歲獨走，5 歲能跑，但運動耐力差。首次來院時9 歲，行走速度慢且不穩(wěn)，行走時左上肢內(nèi)收內(nèi)旋姿勢，吞咽慢，言語及智力發(fā)育正常。#4 患兒4 歲出現(xiàn)肢體乏力，5 歲出現(xiàn)易跌倒，9歲需坐輪椅，13 歲完全臥床，有嚴重的脊柱側(cè)彎，生活不能自理。另外2 例患兒（#5，#6）為其母首次自然受孕，異卵雙生的男性患兒，兄弟二人既往被診斷“腦性癱瘓”，長期康復(fù)治療，病情無改善。平素發(fā)熱后精神運動發(fā)育會倒退（表1）。

2.2 輔助檢查

6 例患兒肝腎功能、銅藍蛋白、血乳酸、血氨、血漿氨基酸、?；鈮A、尿有機酸、甲狀腺功能、頭顱磁共振成像及神經(jīng)生理測試（腦電圖，腦干聽覺和視覺誘發(fā)電位）等檢查均未見異常。

2.3 6例THD患兒的基因檢測結(jié)果

對4 個家系6 例THD 患兒行全外顯子基因檢測，其中患兒#3，#4來自同一家庭，#3為弟弟，#4為姐姐，姐弟兩人的TH基因突變位點一致；患兒#5，#6 來自同一家庭，為其母異卵雙生，自然受孕的兄弟，兄弟兩人的TH基因突變位點一致。在我們的病例系列中發(fā)現(xiàn)了TH基因的6 個錯義突變以及1個移碼突變。6 例患兒的TH基因均為復(fù)合雜合突變，與常染色體隱性遺傳一致。其中既往文獻報道過的突變位點5 個，包括：c.698G＞A（p.R233H）、c.1145T＞C（p.I382T）、c.739G＞A（p.G247S）、c.1481C＞T（p.T494M）、c.880G＞C（p.G294R）；我們的研究發(fā)現(xiàn)新的錯義突變c.1279A＞G（p.Y427H）及移碼突變c.1128_1138del（p.Q377GfsTer12）。在本研究中，最常見的點突變?yōu)閏.1145T＞C（p.I382T），6 例患兒中3 例（50%）檢出該位點突變（表2）。TH 蛋白由4個亞基組成，每個亞基含3個結(jié)構(gòu)域：1.調(diào)控結(jié)構(gòu)域，2.催化區(qū)域3.四聚體化結(jié)構(gòu)域。本研究6例患兒存在的7 個突變位點均位于催化域（圖1）。

表1 6例THD患兒的臨床表現(xiàn)、治療和預(yù)后Table 1 Clinical manifestations，treatment and prognosis of 6 children with THD

2.4 治療與隨訪

本研究的所有患兒均服用美多芭（左旋多巴/鹽酸芐絲肼50 mg/200 mg 分散片，Madopa）治療。根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)和對副作用的耐受性進行調(diào)整。6例患兒開始美多芭治療的中位數(shù)年齡為2歲2 個月（范圍從13 個月到17 歲2 個月）。中位數(shù)治療時間為1 年3 個月（范圍從3 個月到3 年5 個月）。美多芭的初始劑量為2.1～5.5 mg/（kg·d）。目前美多芭的維持劑量為2～15 mg/（kg·d），分2～3 次服用。6 例患兒運動功能均顯著改善。中位數(shù)隨訪時間為1 年3 個月（范圍從3 個月到3 年5 個月）。5例患兒（#1，#2，#4，#5，#6）美多芭治療后，能夠獨立行走的中位數(shù)時間為4 個月（范圍從2 周到13 個月），#3 患兒（治療前可獨走，但姿勢異常）在治療開始后1 周，行走姿勢恢復(fù)正常，隨訪中癥狀持續(xù)改善。6 例患兒韋氏智力測試結(jié)果均在正常范圍，但患兒#2，#5，#6 韋氏智力測試中，語言理解能力分值低于平均水平（表1）。

表2 6例酪氨酸羥化酶缺乏患兒的TH基因檢測結(jié)果Table 2 TH gene test results of 6 children with tyrosine hydroxylase deficiency

圖1 人類TH和本研究6例患兒突變位點的序列比對Fig.1 Sequence alignment of mutant sites between human TH and the 6 children in this study

3 討論

DRD 是常染色體遺傳運動障礙，是一種嚴重但可治療的神經(jīng)代謝性疾病，發(fā)生在兒童和青少年。其特征是進行性肌張力障礙，對低劑量左旋多巴治療可有顯著反應(yīng)。DRD 的遺傳模式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、散發(fā)，其中由GCH1基因突變引起的常染色體顯性遺傳的DRD最為常見。相比之下，TH基因突變引起THD 為常染色體隱性遺傳，是DRD 罕見的發(fā)病機制，相較于GCH1基因突變引起的DRD，其癥狀更重，發(fā)病更早。

DRD 患兒女性居多，女性是男性患兒的2.5～4倍。GCH1基因突變引起的DRD 在女性患兒中的外顯率是男性的2.3 倍［5］，而Willemsen 等［6］對36 例THD 患兒的研究報道顯示THD 患兒無明顯性別差異。結(jié)合本研究的6 例THD 男女比例為4：2，提示THD并未呈現(xiàn)絕大多數(shù)DRD的女性優(yōu)勢比。

THD 多在生后數(shù)周到5 歲起病，常為下肢起病的部分性或全身性肌張力不全，最常見的癥狀是運動減少，軀干肌張力降低和肢體肌張力增高［7］。與既往文獻報道的38.7%患兒有晨輕暮重表現(xiàn)相仿［8］，本研究33.3%（2/6）的患兒有晨輕暮重表現(xiàn)。70%患兒在15 歲前即可出現(xiàn)嚴重癥狀［6］。根據(jù)癥狀的嚴重程度和對左旋多巴的反應(yīng)性，THD 有3 種類型［4］，分別為1 型：左旋多巴反應(yīng)性肌張力不全（經(jīng)典的DRD），2 型：嬰兒帕金森癥伴運動延遲，3型：進行性嬰兒腦病。與1型THD患兒相比，2型及3型的運動及認知功能預(yù)后較差。本研究的6例患兒均屬于1 型THD。THD 具有廣泛的臨床異質(zhì)性，常被誤診為腦癱或遺傳性痙攣性截癱，體格檢查均可存在下肢腱反射活躍、肌張力增高等。THD也可能因為出現(xiàn)發(fā)作性肌張力障礙和異常行為而被誤診為癲癇。在本研究中，2 例患兒（#5，#6）既往在被誤診為腦癱，2 例患兒（#3，#4）被誤診為遺傳性痙攣性截癱。與THD 相比，腦癱是非進展性疾病，左旋多巴治療無效，神經(jīng)影像學(xué)可異常。而腦電圖即可幫助鑒別癲癇與非癲癇性發(fā)作。此外，THD的晨輕暮重現(xiàn)象應(yīng)與重癥肌無力相鑒別，但前者新斯的明試驗陰性，左旋多巴治療有效，可予鑒別?？偟膩碚f，由于小劑量的左旋多巴可以使絕大多數(shù)THD 患兒明顯改善，因此應(yīng)考慮對肌張力障礙患兒進行左旋多巴試驗，以免誤診。

酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是兒茶酚胺（即多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素）生物合成中的限速酶。TH 主要在腦和腎上腺表達。因此，通過獲取組織樣本進行酶學(xué)測定是不太可行的。THD 患兒腦脊液多巴胺代謝產(chǎn)物高香草酸和高香草酸與5-羥基吲哚乙酸比值降低，去甲腎上腺素代謝產(chǎn)物3-甲氧基-4-羥基苯基乙二醇降低，生物蝶呤和新蝶呤濃度正常［6］。然而，并不是所有的患兒都愿意接受侵入性檢測，這突顯了DRD 相關(guān)基因遺傳分析的優(yōu)勢。TH基因位于染色體11p15.5，其包含14 個外顯子，開放閱讀框為1491bp，編碼497 氨基酸。TH基因的純合突變或復(fù)合雜合突變可引起THD。TH基因的錯義突變是THD 的主要原因。截止至2020 年10 月，HGMD 數(shù)據(jù)庫已經(jīng)報道了88 個致病TH基因突變。其中c.698G＞A（p.R233H）為熱點突變［9］。Van den Heuvel等［10］報道了3例純合突變p.R233H 患兒，癥狀符合2 型THD。Zhang［11］等亦報道了TH基因復(fù)合雜合突變的1例患兒，其存在1個p.R233H 突變，患兒亦表現(xiàn)為2 型THD。因此p.R233H 突變被預(yù)測與2型THD 有關(guān)。而本研究患兒#1 存在TH基因p.R233H 突變，但其臨床表現(xiàn)為1 型THD。因此本研究結(jié)果提示p.R233H 突變并不能作為臨床表型預(yù)測的指標。目前THD 基因型與表型之間的相關(guān)性尚未建立，但隨著TH蛋白功能的進一步研究，這將成為可能。本研究6 例患兒均為TH基因的復(fù)合雜合突變引起的THD。6 例患兒共有7 個TH基因突變，其中2個是既往未見報道的新突變?；純?1存在TH基因c.1279A＞G 突變，導(dǎo)致氨基酸改變p.Y427H（該基因編碼的第427 位密碼子由酪氨酸變?yōu)榻M氨酸），為錯義突變，患兒#3 及#4 存在TH基因c.1128_1138del 突變，導(dǎo)致氨基酸p.Q377GfsTer12（此序列變化導(dǎo)致第377 號氨基酸由谷氨酰胺變成甘氨酸，且下游第12 號氨基酸變?yōu)榻K止密碼），為移碼突變，突變位點在多物種比對具有高度保守性，不屬于多態(tài)性位點，通過SIFT、PolyPhen、MutationTaster等軟件均預(yù)測其致病，國內(nèi)外均未見相同突變報道?；純?3 及#4 雖來自同一家庭，基因突變位點一致，但兩者在性別、起病年齡、臨床表現(xiàn)、嚴重程度及疾病進程方面均存在差異，這也體現(xiàn)了該病的遺傳異質(zhì)性。另外有3例（50%）患兒存在相同TH基因突變位點，c.1145T＞C（p.I382T）。該位點首次由臺灣學(xué)者于2012 年報道［9］。本研究3 例患兒為繼臺灣學(xué)者報道后的再次報道。該位點是否呈現(xiàn)在中國人群高發(fā)趨勢，有待更大樣本的研究。

治療方面，左旋多巴是治療THD 的神奇藥物。左旋多巴用量采用逐步滴定法。起始劑量通常為0.5～1 mg/（kg·d），每月增加0.1～0.5 mg/（kg·d），根據(jù)療效及患兒對藥物的耐受情況，維持劑量為3～10 mg/（kg·d），分1～3 次口服［12］。左旋多巴安全、有效，在劑量增加過快或過大時，可引起左旋多巴誘導(dǎo)的運動障礙。Couto 等［13］報道1 例患兒從起病到使用左旋多巴治療相差19 年?；純簾o法執(zhí)行任何運動任務(wù)，借助輪椅15 年。左旋多巴治療后，患兒有異常緩慢但持續(xù)的改善過程，筆者分析左旋多巴起效緩慢可能與該患兒長期的運動功能喪失相關(guān)。國內(nèi)段麗芬等［14］報道1 例11 歲大患者，臥床11 年，經(jīng)左旋多巴治療取得扭轉(zhuǎn)性效果，現(xiàn)已能基本正常生活，且副作用小。本研究患兒#4 雖然從起病到診斷明確，采用左旋多巴治療，相差13年，其中完全臥床，生活不能自理長達4 年，但依然顯示出對左旋多巴快速而顯著的反應(yīng)，而患兒#2規(guī)則服用美多芭治療前，病程僅4 個月，但從服藥到病情明顯改善則經(jīng)歷近1 年時間，提示對藥物反應(yīng)的快慢，不完全由患兒病程決定，還可能與患兒的基因型，藥物吸收情況等因素相關(guān)，這有待進一步探討。盡管大多數(shù)患兒在左旋多巴啟用后的2周即可表現(xiàn)療效［6］，但仍有少數(shù)患兒在數(shù)月內(nèi)才有治療反應(yīng)（本研究患兒#2），因此，應(yīng)耐心觀察足夠長的時間，以客觀判斷藥物療效，不可操之過急。

本研究存在一定局限性。首先，這是一項單中心、回顧性研究，可能造成選擇偏倚。其次，研究納入樣本量較少，這與THD 為罕見病不無關(guān)系。今后我們計劃開展多中心、大樣本、前瞻性的研究，進一步總結(jié)THD患兒的臨床和遺傳特征。

綜上所述，THD是一種罕見且嚴重的神經(jīng)代謝疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，盡早識別和左旋多巴治療，可明顯改善預(yù)后。THD的診斷依賴于臨床癥狀，左旋多巴診斷性治療和TH基因的檢測。本研究檢測到TH基因2 個新的突變，錯義突變c.1279A＞G 及移碼突變c.1128_1138del。本研究拓寬了THD 的基因型譜，為了解THD 的分子機制提供了新的思路?；驒z測是THD 最重要的診斷方法，對后續(xù)治療及遺傳咨詢有指導(dǎo)意義。