響應(yīng)面優(yōu)化油樺中三萜類化合物提取工藝

韓月　李占君　李夢(mèng)媛　楊逢建

摘 要：為研究油樺中三萜類化合物的提取工藝，以油樺樹(shù)皮為原料，采用超聲法提取三萜類化合物，建立油樺中三萜類化合物的高效液相色譜測(cè)定方法。應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法考察不同超聲因素對(duì)油樺中三萜類化合物總提取率的影響。最后得到的最佳條件為：超聲功率380 W，提取時(shí)間42 min，提取溫度63 ℃。油樺三萜類化合物的總提取率為280.72%，與理論推測(cè)值281.54%±0.55%一致。結(jié)果表明，超聲法提取三萜類化合物工藝合理可靠，提取率高。

關(guān)鍵詞：油樺;三萜類化合物;高效液相色譜法;超聲提取;響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ654.2;TS205.4?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1006-8023（2021）02-0079-07

Optimization of the Extraction Process of Triterpenoids

from Betula ovalifolia by Response Surface

HAN Yue1， LI Zhanjun2， LI Mengyuan1， YANG Fengjian1*

（1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology， Ministry of Education， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;

2.Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry， Yichun 153000， China）

Abstract：In order to study the extraction process of triterpenoids in Betula ovalifolia， the Betula ovalifolia bark was used as raw material to extract triterpenoids by ultrasonic method， and a high performance liquid chromatography method for the determination of triterpenoids in Betula ovalifolia was established. Single factor experiment and response surface method were used to investigate the effect of different ultrasonic factors on the total extraction yield of triterpenoids in Betula ovalifolia. The best condition obtained in the end was： ultrasonic power was 380 W， extraction time was 42 min， extraction temperature was 63 ℃. The total extraction yield of triterpenoids from Betula ovalifolia was 280.72%， which was consistent with the theoretically estimated value of 281.54% ± 0.55%. The results showed that the ultrasonic extraction of triterpenoids was reasonable and reliable， and the extraction rate was high.

Keywords：Betula ovalifolia; triterpenoids; high performance liquid chromatography; ultrasonic extraction; RSM

收稿日期：2020-11-09

基金項(xiàng)目：黑龍江省林業(yè)科技項(xiàng)目（Hljlykj2018-1）

第一作者簡(jiǎn)介：韓月，碩士研究生。研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)。E-mail： 1515538905@qq.com

通信作者：楊逢建，博士，教授。研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)。E-mail： yangfj@nefu.edu.cn

引文格式：韓月，李占君，李夢(mèng)媛，等. 響應(yīng)面優(yōu)化油樺中三萜類化合物提取工藝[J].森林工程，2021，37（1）：79-85.

HAN Y， LI Z J， LI M Y， et al. Optimization of the extraction process of triterpenoids from Betula ovalifolia by response surface[J]. Forest Engineering，2021，37（1）：79-85.

0 緒論

油樺（Betula ovalifolia）是樺木科樺木屬的一種灌木，分布于中國(guó)東北部地區(qū)[1]。近年來(lái)，從天然植物中提取和分離活性物質(zhì)用于臨床藥物的研究和開(kāi)發(fā)已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，樺樹(shù)皮中含有大量的三萜類化合物，功效應(yīng)用廣[2-4]。其中白樺脂酸、白樺脂醇和羽扇豆醇等為樺樹(shù)皮中的天然活性成分。三萜類化合物具有抗腫瘤、抗炎和抗病毒的作用。特別是針對(duì)艾滋病具有良好的生物學(xué)抗性，在藥物研發(fā)中有很高的利用價(jià)值[5-8]。

目前對(duì)樺木屬植物的研究主要集中在白樺樹(shù)皮中三萜類化合物的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定等方面[9-12]。而對(duì)油樺的研究大多集中在植被覆蓋、群落生態(tài)以及林下經(jīng)濟(jì)等方面，其活性物質(zhì)的提取以及含量的測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道[13-15]。

超聲提取具有操作簡(jiǎn)單、超聲水浴可同時(shí)做多個(gè)樣品、實(shí)驗(yàn)效率高、超聲波震動(dòng)作用能使物質(zhì)充分溶出、提取率高等特點(diǎn)，使其成為提取植物中天然活性成分的常用方式[16-17]。小興安嶺植物資源眾多，油樺分布廣泛，其中的天然活性成分具有很大的藥用價(jià)值和發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)以乙酸乙酯為提取溶劑，超聲輔助提取，利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)油樺中三萜類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為油樺中三萜類化合物的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

油樺樹(shù)皮于2020年6月在黑龍江省小興安嶺采集。實(shí)驗(yàn)用品：白樺脂酸、白樺脂醇、羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）、實(shí)驗(yàn)用超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）、乙酸乙酯（天津富宇精細(xì)化工有限公司）、色譜乙酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）、色譜級(jí)乙腈（SK公司）、色譜級(jí)甲醇（SK公司）等藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（型號(hào)：1260，美國(guó)安捷倫公司）;電子分析天平（型號(hào)：UH620H，日本SHIMADZU島津）;醫(yī)用離心機(jī)（型號(hào)：H1650，長(zhǎng)沙市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)器有限公司）;數(shù)控超聲波清洗機(jī)（型號(hào)：JP-100ST，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備

將油樺樹(shù)皮置60 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥，粉碎機(jī)破碎，過(guò)篩，收集起來(lái)備用。取油樺樹(shù)皮粉末0.5 g，倒入25 mL容量瓶中，加入提取溶劑乙酸乙酯10 mL，超聲處理30 min;制備完畢，將提取混合溶液放置室溫冷卻，定容搖勻。用移液槍吸取提取液5 mL，移入10 mL離心管，高速（10 000 r/min）離心10 min，取上清液即為待測(cè)溶液。

2.2 液相色譜條件

Diamonsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。白樺脂酸、白樺脂醇檢測(cè)條件：

流動(dòng)相A為乙腈（含0.1 %乙酸），流動(dòng)相B為水（含0.1 %乙酸），梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1[18];柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;進(jìn)樣量為10 μL。羽扇豆醇檢測(cè)條件：以100%甲醇為流動(dòng)相;流速為1.2 mL/min;柱溫為25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;進(jìn)樣量為10 μL[19]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將白樺脂酸、白樺脂醇、羽扇豆醇3種標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于無(wú)水乙醇，0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的母液，用無(wú)水乙醇將白樺脂酸、白樺脂醇、羽扇豆醇的母液依次稀釋質(zhì)量濃度為31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用液相色譜確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰時(shí)間，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。得到：白樺脂酸回歸方程為y=7 360.9x-5.947 3（R2=0.999 6），線性范圍為31.25～1 000 μg/mL;白樺脂醇回歸方程為 y=7 597.8x+29.983（R2=0.999 5），線性范圍為31.25～1 000 μg/mL;羽扇豆醇回歸方程為y=3 018.8x+11.911（R2=0.999 8），線性范圍為31.25～1 000 μg/mL。對(duì)照品及樣品色譜圖如圖1和圖2所示。

2.4 總提取率的測(cè)定

將供試品溶液測(cè)得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，分別計(jì)算出油樺樹(shù)皮中所含白樺脂酸、白樺脂醇和羽扇豆醇3種有效物質(zhì)的提取率，計(jì)算公式為：

Y0 = （M1 / M2） × 100%。? （1）

式中：Y0為有效物質(zhì)得率，%;M1為有效物質(zhì)提取所得質(zhì)量的算術(shù)平均值，g;M2為未經(jīng)提取處理前油樺樹(shù)皮粉末質(zhì)量，g。

Y1 =（ Ma / Mb））× 100%。?? （2）

式中：Y1為有效物質(zhì)含有率，%;Ma為有效物質(zhì)完全充分提取所得質(zhì)量的算術(shù)平均值，g;Mb為未經(jīng)提取處理前油樺樹(shù)皮粉末質(zhì)量，g。

Y2 = （Y0 / Y1 ）× 100%。?? （3）

式中：Y2為有效物質(zhì)提取率，%;Y0為有效物質(zhì)得率，%;Y1為有效物質(zhì)含有率，%。

Y總 = y1 +y2 +y3。???????? （4）

式中：Y總為總提取率，%;y1為白樺脂酸提取率，%; y2為白樺脂醇提取率，%; y3為羽扇豆醇提取率，%。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與處理用 Origin Pro 9.0和Design Expert 10。

2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

2.6.1 不同功率對(duì)總提取率的影響

具體操作為：稱取干燥過(guò)的樹(shù)皮粉末0.5 g，固定水浴溫度30 ℃，液料比15∶1 mL/g，時(shí)間30 min，研究功率為200、300、400、500、600 W條件下對(duì)總提取率的影響。

2.6.2 不同液料比對(duì)總提取率的影響

稱取干燥后的樹(shù)皮粉末0.5 g。固定條件：功率400 W，水浴溫度30 ℃，時(shí)間30 min，考查液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g對(duì)總提取率的影響。

2.6.3 不同提取時(shí)間對(duì)總提取率的影響

稱取干燥樹(shù)皮粉末0.5 g，固定功率400 W，水浴溫度30 ℃，液料比20∶1 mL/g，分別研究10、20、30、40、50 min條件下對(duì)總提取率的影響。

2.6.4 不同提取溫度對(duì)總提取率的影響

稱取干燥樹(shù)皮粉末0.5 g，固定功率400 W，液料比20∶1 mL/g，時(shí)間40 min，探討溫度30、40、50、60、70 ℃對(duì)總提取率的影響。

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)總提取率影響程度較高的因素：超聲功率、超聲時(shí)間、水浴溫度作為自變量，采用三因素三水平設(shè)計(jì)Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1.1 不同提取功率對(duì)總提取率的影響

隨著功率的增加，總提取率先升高后降低（圖3），當(dāng)超聲功率達(dá)到400 W時(shí)，總提取率達(dá)到最大值;功率在400 W后，總提取率開(kāi)始下降。主要原因在于超聲的空化作用和直進(jìn)流作用在400 W時(shí)達(dá)到了飽和狀態(tài)，使溶質(zhì)充分溶解，所以超聲功率為400 W。

3.1.2 不同液料比對(duì)總提取率的影響

液料比不斷增大，總提取率逐漸上升，當(dāng)液料比達(dá)到20∶1 mL/g時(shí)，總提取率最高（圖4），表明溶質(zhì)的滲出率高，在溶劑中的溶解度達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡。進(jìn)一步增加溶劑的用量，總提取率下降。由于溶劑的增多致使三萜類化合物的含量下降，液料比以20∶1 mL/g進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

3.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)總提取率的影響

隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總提取率逐漸升高，延長(zhǎng)時(shí)間，溶質(zhì)溶解的較好，但40 min之后總提取率趨于穩(wěn)定甚至略有下降（圖5）。當(dāng)油樺中的三萜類有效成分在溶劑擴(kuò)散過(guò)程中達(dá)到平衡時(shí)，總提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化，因此選用提取時(shí)間為40 min進(jìn)行下一步的優(yōu)化設(shè)計(jì)。

3.1.4 不同提取溫度對(duì)總提取率的影響

在40～60 ℃，隨著提取溫度的增加，總提取率逐漸增大（圖6）。在60 ℃時(shí)達(dá)到了較好的提取效果，其原因是溫度高、介質(zhì)溶出速率高、滲透速度快、溶解度大，提高了總提取率。但是過(guò)高的溫度，易使溶劑揮發(fā)和破壞物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)，影響提取率。因此最佳提取溫度為60 ℃。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

按照表2的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的回歸方程為：

Y（%）=+280.08-5.36A+4.26B+3.41C-1.35AB-0.17AC+3.51BC-12.61A2-14.95B2-7.51C2。

根據(jù)表4方差分析結(jié)果來(lái)看，該擬合優(yōu)化模型F=80.72，P< 0.01，表明該擬合優(yōu)化模型差異極顯著，而失擬項(xiàng)中F=3.80，P=0.115 2>0.05，表示差異不顯著，模型擬合度良好。且A、B、C各因素之間互不干擾。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能較好地反映提取功率、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)總提取率的顯著影響。模型中的單一因素功率（A）、時(shí)間（B）、溫度（C）和二次項(xiàng)中的A2、B2、C2，以及組合性因素中的BC的P值均小于0.01，表明對(duì)油樺三萜類化合物總提取率有極顯著影響;組合性因素AB、AC的P值均大于0.05，影響不顯著，說(shuō)明交互作用弱。根據(jù)F值的大小，判斷各超聲因素對(duì)總提取率影響的強(qiáng)弱為：A>B>C，3者共同影響三萜類化合物的總提取率。

擬合優(yōu)化模型的綜合決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為R2 = 0.990 5和AdjR2 = 0.978 2（表5）。表明回歸模型具有較高的擬合度，模型和方程可以用來(lái)推斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該模型可用于優(yōu)化油樺中三萜類化合物的提取工藝。

3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化傘狀圖

響應(yīng)面底部的投影是一個(gè)等高線圖，等高線圖的形狀反映了這2個(gè)因素之間的相互作用。圖7底部的投影為圓形，表明功率A和時(shí)間B的交互作用不顯著，圖8底部的投影為圓形，表示功率A和溫度C之間的相互作用不顯著，圖9底部的投影為橢圓形，表示時(shí)間B和溫度C的交互作用強(qiáng)，即時(shí)間和溫度的交互作用對(duì)油樺中三萜類化合物的提取率影響顯著，這與響應(yīng)面優(yōu)化的模型方程方差分析結(jié)果相符。

3.2.3 最優(yōu)工藝條件的驗(yàn)證與對(duì)比實(shí)驗(yàn)

通過(guò)回歸模型分析，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件為：超聲功率377.59 W，提取時(shí)間41.84 min，提取溫度62.72 ℃。在此條件下，三萜類化合物的總提取率達(dá)到281.54%?？紤]到實(shí)際情況的可操作性，調(diào)整

參數(shù)為：超聲功率380 W，提取時(shí)間42 min，提取溫度63 ℃。進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到的總提取率值為280.72%，與理論值281.54% ± 0.55%接近，表明優(yōu)化的條件可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以乙酸乙酯為溶劑，采用超聲提取，利用高效液相色譜法檢測(cè)三萜類化合物含量。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了三萜類化合物的提取條件，采用響應(yīng)面法建立了油樺中三萜類化合物總提取率的回歸模型。根據(jù)擬合優(yōu)化模型，各超聲因素對(duì)總提取率的影響由大到小順序?yàn)椋汗β剩ˋ）、時(shí)間（B）、溫度（C）。獲得的最佳提取條件為：超聲功率380 W，提取時(shí)間42 min，提取溫度63 ℃，總提取率為280.72%。這與曾慧慧等[20]研究的超聲提取海南眼樹(shù)蓮中三萜類化合物獲得的工藝條件基本相符，與理論預(yù)測(cè)值281.54%±0.55%偏差不大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。該工藝條件可為油樺中三萜類化合物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

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