唐梁， 梁偉海， 陳志寧， 林國偉， 劉曉俊*， 歐陽櫻君

（廣州市第一人民醫(yī)院 1 中醫(yī)科， 2 神經內科， 廣東 廣州510180）

卒中后認知障礙 （PSCI） 是腦卒中的重要并發(fā)癥， 發(fā)病率極高 （80.97%）［1－2］， 對患者的自理能力及生存質量產生嚴重的影響。 著名中醫(yī)腦病專家劉茂才教授研制出治療PSCI 的癡復康方， 其臨床療效顯著， 但作用機制尚未明確。 NR2B／CaMKⅡ信號通路廣泛存在于腦神經元中， 促進神經突觸的重塑、 學習、 記憶功能， HMGB－1、 TGF－β1／Smad 信號通路在PSCI 發(fā)病過程中誘導神經元的損傷和凋亡。 基于此， 本實驗通過對48 只大鼠雙側頸總動脈結扎制作PSCI 模型， 觀察癡復康方對大鼠的空間學習、 記憶能力的改善情況， 檢測NR2B／CaMKⅡ信號通路及HMGB－1、 TGF－β1／Smad 信號通路以闡明其可能的作用機制， 現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠48 只， 雄性， 體重180 ～220 g， 由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供 ［許可證號： SCXK （粵） 2018－0002］。

1.2 造模

SD 大鼠分離出左右頸總動脈， 用止血鉗夾住近心端頸總動脈， 用彎頭鑷排空遠心端血管中的血液， 對雙側頸總動脈行兩點結扎。

1.3 分組及給藥方法

將48 只SD 大鼠隨機分為正常組、 模型組、 尼莫地平組以及癡復康方低、 中、 高劑量組， 每組8 只。 正常組實施假手術， 其余均實施雙側頸總動脈結扎術。 低、 中、 高劑量組分別予以癡復康0.22 g·kg－1·d－1、 0.44 g·kg－1·d－1、 0.88 g·kg－1·d－1灌胃， 尼莫地平組予以尼莫地平1 mg·kg－1·d－1， 模型組、 正常組予以生理鹽水10 mL·kg－1·d－1， 均為1 次／d， 連續(xù)30 d。

1.4 Morris 水迷宮實驗測試大鼠的空間學習和記憶能力

1.4.1 獲得性訓練

將水迷宮裝置水池分為4 個象限， 平臺置于其中一個象限區(qū)的中央。 將大鼠頭朝池壁放入水中， 記錄動物找到水下平臺的時間 （s）， 連續(xù)訓練5 d。

1.4.2 定向航行實驗

第30 d 藥后1 h， 將大鼠面向池壁放入水中， 入水順序為Ⅲ象限→Ⅰ象限→Ⅳ象限→Ⅱ象限， 記錄90 s 內大鼠登上平臺并停留3 s 所用時間， 即逃避潛伏期 （s）， 超過90 s 記為90 s。

1.4.3 空間探索實驗

完成定向航行測試后， 立即撤去平臺， 將大鼠從原平臺象限對側第Ⅰ象限面向池壁放入水中， 記錄90 s 內大鼠穿越原平臺次數(shù) （次） 和原平臺象限停留時間 （s）。

1.5 病理切片觀察

各組大鼠取腦組織， 經過固定、 脫水、 包埋、 切片、 染色， 在顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 qPCR 法檢測大鼠腦組織中NR2B、 CaMKⅡ、 HMGB-1、TGF-β1、 Smad7 mRNA 的表達量

根據Trizol 總RNA 提取試劑說明書提取總RNA， 測定濃度和純度， 取500 ng 總RNA 用于cDNA 合成， 根據TaKaRa逆轉錄試劑盒合成cDNA 用于實時熒光定量PCR 反應， 檢測mRNA 的表達情況。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據。 計量資料符合正態(tài)分布的， 以± s 表示， 采用單因素方差分析， 多重比較采用LSD 法，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癡復康方對大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺次數(shù)、 原平臺象限停留時間的影響

與正常組相比， 模型組的逃避潛伏期延長， 穿越原平臺次數(shù)減少， 原平臺象限停留時間縮短， 差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）。 與模型組相比， 低、 中、 高劑量組逃避潛伏時間均縮短， 原平臺象限停留時間均延長， 差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）。 與模型組相比， 中、 高劑量組穿越原平臺次數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）。 見表1。

表1 癡復康方對大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺次數(shù)和原平臺象限停留時間的影響 （ ± s）

表1 癡復康方對大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺次數(shù)和原平臺象限停留時間的影響 （ ± s）

注： 與正常組比較， aP ＜0.01； 與模型組比較， bP ＜0.01。

組別 n 逃避潛伏期 （s） 穿越原平臺次數(shù)（次）原平臺象限停留時間 （s）高劑量組 8 43.89±7.56b 7.502±1.61b 25.79±9.17b中劑量組 8 52.49±10.13b 6.501±1.60b 24.05±7.67b低劑量組 8 62.27±9.32b 4.875±2.03 23.44±4.02b尼莫地平組 8 46.22±10.57 7.125±1.25 25.16±4.87模型組 8 68.63±14.43a 3.625±1.06a 10.15±3.90a正常組 8 51.67±9.80 8.250±1.49 26.88±3.43

2.2 病理切片觀察

模型組大鼠海馬神經元明顯減少， 細胞排列松散， 不規(guī)則， 部分可見核仁消失、 錐體細胞減少； 癡復康方低、 中、 高劑量組隨著劑量增加， 大鼠海馬組織神經元細胞結構改善明顯， 神經元增加， 壞死細胞明顯減少， 細胞核固縮減少， 正常神經元增加， 細胞輪廓清晰， 排列整齊， 其中以高劑量組改善最明顯。 見圖1。

圖1 病理改變HE 染色 （×100）

2.3 癡復康方對NR2B、 CaMKⅡ的影響

與正常組相比， 模型組的NR2B、 CaMKⅡ表達減少， 差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）； 與模型組相比， 低、 中、 高劑量組的NR2B、 CaMKⅡ表達均增加， 差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）。見表2。

表2 癡復康方對NR2B、 CaMKⅡ的影響 （ ± s）

表2 癡復康方對NR2B、 CaMKⅡ的影響 （ ± s）

注： 與正常組比較， aP ＜0.01； 與模型組比較， bP ＜0.01； 與尼莫地平組比較， cP ＜0.01。

組別 n NR2B CaMKⅡ高劑量組 8 0.88±0.05b 0.95±0.16b中劑量組 8 0.42±0.03bc 0.72±0.05b低劑量組 8 0.44±0.05bc 0.60±0.07bc尼莫地平組 8 0.97±0.11 0.90±0.13模型組 8 0.16±0.01a 0.13±0.01a正常組 8 1.00±0.09 1.00±0.06

2.4 癡復康方對HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響

與正常組相比， 模型組的HMGB－1、 TGF－β1、 Smad7 表達均增加， 差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）； 與模型組相比， 中、高劑量組的HMGB－1 表達均減少， 差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）； 與模型組相比， 低、 中、 高劑量組的TGF－β1、 Smad7表達均減少， 差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01）。 見表3。

表3 癡復康方對HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響 （ ± s）

表3 癡復康方對HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響 （ ± s）

注： 與正常組比較， aP ＜0.01； 與模型組比較， bP ＜0.01； 與尼莫地平組比較， cP ＜0.01。

組別 n HMGB－1 TGF－β1 Smad7高劑量組 8 1.01±0.26b 0.92±0.05b 0.92±0.05b中劑量組 8 1.17±0.44b 1.83±0.10bc 1.83±0.10bc低劑量組 8 2.17±0.26c 2.27±0.16bc 2.27±0.16bc尼莫地平組 8 1.14±0.13 1.14±0.13 1.14±0.13模型組 8 2.21±0.23a 2.58±0.18a 2.58±0.18a正常組 8 1.00±0.10 1.00±0.09 1.00±0.09

4 討論

卒中后認知障礙 （PSCI） 的發(fā)病機制目前尚未完全明確，有相關研究［3］認為其可能與腦關鍵部位血管損害、 腦神經退行性病變、 腦部炎性反應及遺傳有關。 N－甲基－D－天門冬氨酸（NMDA） 受體是一種分布在大腦海馬和皮層的離子通道型谷氨酸受體， 通過調控突觸可塑性和神經元突觸長時程增強效應，在學習、 記憶方面起重要作用。 NR2B 作為NMDA 受體的重要功能亞基， 對于前額葉皮層神經元突觸長時程增強效應的形成以及依賴前額葉皮層相關記憶的形成發(fā)揮重要作用［4］。 CaMKⅡ是大腦組織內的非脯氨酸依賴蛋白激酶， 是學習、 記憶的分子基礎， 參與神經元突觸長時程增強效應。 NR2B 被激活后，促進Ca2＋內流激活CaMKⅡ， 刺激CaMKⅡ下游信號通路， 引起突觸后膜致密區(qū)磷酸化， 促進神經元突觸長時程增強效應， 促進NR2B 表達， 從而增強學習記憶能力［5］。 但NR2B 過度表達會引起神經元內Ca2＋超載而損害神經元， 導致疾病發(fā)生［6］。NR2B／CaMKⅡ信號通路存在雙向作用， 既能改善認知功能，也可損害認知功能， 所以調節(jié)NR2B／CaMKⅡ信號通路是治療認知功能障礙的重要靶點。

炎性因子在認知功能障礙發(fā)病中也起到重要的作用。HMGB－1 是組織受到缺血缺氧等刺激后大量釋放至細胞外的促炎性因子， 會加劇機體炎癥［7-8］。 相關研究［9］表明， HMGB－1在血管性癡呆患者血清中高表達， 且與其嚴重程度呈正相關，與患者預后有明顯相關性。 TGF－β1／Smad 信號通路參與血管性癡呆的發(fā)病機制［10］： TGF－β1 在海馬等組織中表達， 與細胞膜受體結合， 使Smad 磷酸化， 調節(jié)靶向基因的表達， 其中Smad7 誘導細胞凋亡。

本實驗結果表明， 癡復康方能夠改善PSCI 大鼠的空間學習、 記憶能力， 其機制可能與減少海馬神經元壞死， 上調海馬組織NR2B、 CaMKⅡmRNA 表達， 下調HMGB－1、 TGF－β1、Smad7 mRNA 表達有關， 其治療PSCI 的詳細機制還有待進一步的研究。