周潛 韓燕 劉經(jīng)緯 尹躍平

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院 中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心，南京210042

志賀菌（Shigella）于1898年由Kiyoshi Shiga發(fā)現(xiàn)并命名，是細菌性痢疾的病原體[1]。根據(jù)菌體抗原的結(jié)構(gòu)不同分為4個血清群：痢疾志賀菌（S.dysenteriae）、福氏志賀菌（S.flexneri）、鮑氏志賀菌（S.boydii）和宋內(nèi)志賀菌（S.sonnei）[2]。目前已發(fā)現(xiàn)志賀菌對包括磺胺類、四環(huán)素類、鏈霉素以及喹諾酮類等多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[1]。志賀菌耐藥機制與藥物作用靶位的改變、染色體編碼的外排系統(tǒng)蛋白表達增強和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的表達有關(guān)[3]。2019年，WHO建議將環(huán)丙沙星作為治療志賀菌感染的一線藥物，阿奇霉素、頭孢克肟和頭孢曲松作為二線治療藥物[4]。本文選取喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類與β-內(nèi)酰胺類三類抗菌藥物，綜述了志賀菌耐藥基因及其檢測方法的研究進展和應(yīng)用。

一、志賀菌耐藥基因

1.喹諾酮類耐藥基因

志賀菌耐喹諾酮類藥物的機制主要包括染色體介導(dǎo)的藥物作用靶位基因的改變與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因。染色體介導(dǎo)的氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥主要是編碼DNA回旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的基因發(fā)生突變導(dǎo)致，DNA回旋酶由gyrA和gyrB基因編碼，拓撲異構(gòu)酶Ⅳ由parC和parE基因編碼[5]。突變最常發(fā)生在gyrA基因起始處附近Ala67和Gln107之間的區(qū)域，即喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（QRDR），以gyrA基因上的Ser83、Asp87和His211突變最為常見[6]，并常與parC上的Ser80突變共同發(fā)生，在parC和gyrA區(qū)域發(fā)生多個突變能顯著降低志賀菌對喹諾酮類藥物的敏感性[7]。

質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類抗性區(qū)基因（PMQR），即qnr基因分離物[qnrA、qnrB、qnrS、aac（6’）-Ⅰb-cr]可借助如整合子或插入序列共同區(qū)等可移動遺傳元件，通過接合或轉(zhuǎn)化的方式，在志賀菌與其他腸桿菌科細菌之間傳播[8]。aac（6’）-Ⅰb-cr和qnrS基因分別于1998年和2002年首次在福氏志賀菌2a型和1a型中發(fā)現(xiàn)[9]。Qnr蛋白能直接與DNA結(jié)合，減少回旋酶與DNA的結(jié)合，并保護拓撲異構(gòu)酶Ⅳ免受喹諾酮的侵害，從而逆轉(zhuǎn)喹諾酮類抑制DNA回旋酶的能力，同時Qnr家族蛋白可以提高細菌對喹諾酮類藥物的耐藥突變預(yù)防濃度（MPC）值，從而提高耐藥突變的發(fā)生率。aac（6’）-Ⅰb-cr基因編碼與喹諾酮活性降低相關(guān)的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，這種雙功能酶能乙?；h(huán)丙沙星、諾氟沙星和其他喹諾酮類藥物，但左氧氟沙星不受這種乙酰轉(zhuǎn)移酶的影響[8]。除此以外，在志賀菌中也發(fā)現(xiàn)了mdfA、acrA和acrB等外排泵編碼基因調(diào)節(jié)的喹諾酮類藥物耐藥性[10]。

2.大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因

大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過阻斷50s核糖體中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性，抑制細菌蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抑菌作用。以往的研究認為志賀菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥主要原因為藥物作用靶位的改變，如編碼L22核糖體蛋白的rplV與編碼L4核糖體蛋白的rplD和rrlH基因發(fā)生點狀突變；以及由ompA、ompW、mefA和msrA等外排泵介導(dǎo)的耐藥性。近年的研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的阿奇霉素耐藥基因同樣發(fā)揮重要的作用，包括mph、erm和ere基因[11-12]。mph基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶可使脫氧二甲胺己糖C-2’位置發(fā)生磷酸化而失活，與阿奇霉素耐藥高度相關(guān)，對阿奇霉素高度耐藥（MIC>256 μg/mL）的志賀菌中均發(fā)現(xiàn)攜帶有mphA基因[13]。根據(jù)對mphA相關(guān)質(zhì)粒的研究，志賀菌中mphA耐藥基因的獲得主要來源于大腸桿菌質(zhì)粒的傳播[14]。法國的研究篩查到攜帶p2246-CTXM質(zhì)粒的阿奇霉素耐藥志賀菌上帶有IS26-mphA-mrx-mphR（A）-IS6100基因盒[12]。erm基因是紅霉素甲基化酶基因，使核糖體23S rRNA上特定位點的腺嘌呤甲基化以阻止紅霉素結(jié)合，在以色列發(fā)現(xiàn)攜帶ermB基因的2a型福氏志賀菌菌株表現(xiàn)出對阿奇霉素低敏[15]。

男男性行為者（MSM）人群中發(fā)現(xiàn)的志賀菌表現(xiàn)出對阿奇霉素的敏感性降低，并篩查出多種攜帶大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因的質(zhì)粒，Darton等[16]研究發(fā)現(xiàn)在MSM中暴發(fā)的宋內(nèi)志賀菌和3a型福氏志賀菌中存在具有顯著的DNA同源性的IncFⅠ和IncFⅡ質(zhì)粒，上有erm基因，該基因通過編碼rRNA甲基化酶進行靶位修飾使志賀菌產(chǎn)生耐藥性。英國的一項橫斷面研究對MSM人群中暴發(fā)的3a型福氏志賀菌進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了攜帶mphA和ermB的質(zhì)粒pKSR100，表現(xiàn)為對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的高水平耐藥性[17]，該質(zhì)粒也被證實存在于2a型福氏志賀菌與宋氏志賀菌中[18]。

3.β-內(nèi)酰胺類耐藥基因

志賀菌耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的重要機制是質(zhì)粒中的含有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）基因與AmpC酶基因。ESBLs屬于Ambler分類A類，Bush分類的2be亞群，對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有廣泛水解活性。2004年，首次在孟加拉國發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)ESBLs的志賀菌[19]。迄今為止，已有多個國家和地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)志賀菌攜帶不同類型的ESBLs基因，包括blaTEM、blaSHV和blaCTX-M基因[20-21]，其中CTX-M型ESBLs與 耐 藥性的水平傳播最為相關(guān)，CTX-M-15對哌拉西林、芐青霉素、頭孢曲松和頭孢噻肟具有很高的催化效率[22-23]。在來自中國患者的福氏志賀菌分離株中發(fā)現(xiàn)兩個偶聯(lián)質(zhì)粒IncHI2和IncF，攜帶有blaCTX-M-123的ESBLs基因，該基因由CTX-M-9和CTX-M-1組成，可在福氏志賀菌中水平傳播[24]。SHV基因型ESBLs是廣譜酶SHV-1的編碼基因核苷酸突變形成的酶，如SHV-2相比SHV-1發(fā)生Gly238→Ser突變，具有超廣譜特性[25]。近年還發(fā)現(xiàn)有攜帶SHV-12等SHV型超廣譜酶的志賀菌流行[26]。TEM型內(nèi)酰胺酶根據(jù)其水解底物譜，可分為4類包括廣譜B內(nèi)酰胺酶、ESBLs、耐酶抑制劑β-內(nèi)酰胺酶和CMT。志賀菌中發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM-1基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，引起宋氏志賀菌對氨芐西林的耐藥[27]。

AmpC酶是由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的一類β-內(nèi)酰胺酶，屬于Ambler分類C類，Bush分類的1群，為作用于頭孢菌素且不被克拉維酸抑制的β-內(nèi)酰胺酶。Taneja等[28]研究發(fā)現(xiàn)，有20%對頭孢曲松或頭孢吡肟具有耐藥性的福氏志賀菌產(chǎn)AmpC酶。在中國臺灣的細菌性痢疾流行期間，也發(fā)現(xiàn)耐頭孢曲松的宋內(nèi)志賀菌分離株中存在CMY-2型AmpC β-內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒[29]。

二、志賀菌耐藥基因的檢測方法

1.常規(guī)PCR法

PCR法是將志賀菌耐藥基因作為靶基因，針對基因兩端設(shè)計特異性引物進行擴增，進行瓊脂糖電泳或序列測定以檢測靶基因是否存在或發(fā)生突變的方法。PCR法在耐藥基因檢測方面具有操作簡便、成本低等特點。1994年，Rahman等[30]根據(jù)大腸埃希菌gyrA基因設(shè)計特異性引物，通過結(jié)合PCR法與一代DNA測序技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了喹諾酮耐藥志賀菌gyrA基因上的Ser83突變。之后，更多研究者使用PCR法鑒定出志賀菌耐藥基因，Ezernitchi等[15]使用PCR法對以色列2014—2016年收集的志賀菌進行耐藥基因檢測，其中對阿奇霉素低敏感的志賀菌均帶有mphA和ermB基因。毛聯(lián)鋼等[31]使用PCR法對寧波地區(qū)腸道感染志賀菌喹諾酮類藥物耐藥基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星耐藥菌中97.59%的分離株帶有Ser83、Asp87和Ser80突變。

2.多重PCR法

多重PCR是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展出的一種檢測方法，其在同一PCR反應(yīng)體系里加入2對以上引物，從而可以同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)[32]。對于志賀菌耐藥基因，可同時設(shè)計針對多個基因的特異性引物，選擇合適的退火溫度，實現(xiàn)對多個基因的克隆和鑒定。王倩等[33]使用多重PCR方法，在退火溫度為57.5℃的條件下，可同時擴增出gyrA、parC和毒力致病性基因ipaH用于下一步測序與鑒定。Zhang等[34]使用多重PCR的方法對北京、成都和烏魯木齊等地收集的志賀菌菌株β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物耐藥性進行檢測，發(fā)現(xiàn)可同時對多種ESBLs基因進行檢測。多重PCR較傳統(tǒng)PCR方法耗時較短，但由于引物之間的相互作用，對多重PCR的擴增條件要求較高，需要反復(fù)優(yōu)化調(diào)整復(fù)性條件和引物濃度以增加擴增效率。

3.實時熒光定量PCR法（qPCR）

qPCR是在PCR體系中加入熒光基團，擴增過程中通過熒光信號累積對PCR進程進行實時檢測的方法。根據(jù)RT-qPCR的化學(xué)發(fā)光原理可分為探針類方法（TaqMan探針和分子信標(biāo)）和非探針類方法（SYBR GreenⅠ等熒光染料）。針對志賀菌的QRDR區(qū)gyrA和parC突變，可設(shè)計特異性TaqMan MGB探針對突變堿基進行檢測。Kim等[35]開發(fā)了針對gyrA基因Ser83和Asp87突變與parC基因Ser80和Agr87突變的TaqMan探針，使用qPCR法可檢測是否存在堿基突變，qPCR法的檢測結(jié)果與測序結(jié)果相同。對于質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因，qPCR法可定量檢測耐藥基因及轉(zhuǎn)錄水平。Zhang等[11]對來自中國的392株志賀菌分離株通過qPCR法進行耐藥基因分析，檢測到55%（44/80）的阿奇霉素低敏志賀菌具有mphA基因，未發(fā)現(xiàn)與阿奇霉素耐藥性相關(guān)的外膜蛋白基因ompA和ompW的過表達。相較常規(guī)PCR，qPCR法具有對待測基因進行快速及精確相對定量檢測的特點，并能通過定量mRNA來分析待測基因的表達水平。

4.基因芯片法

基因芯片法又稱DNA微陣列雜交法，主要基于固體基質(zhì)（載玻片或硅薄膜）上的二維陣列以高通量地定性或定量測定DNA分子，其探針由數(shù)kb或幾十個特定核苷酸構(gòu)成，DNA微陣列技術(shù)現(xiàn)主要應(yīng)用分析DNA突變及多態(tài)性、檢測基因表達差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因等多個研究領(lǐng)域[36]。Taitt等[37]開發(fā)了ARDM v.2 DNA芯片，該芯片可識別針對17種抗菌藥物的236個耐藥性基因，每個基因在芯片上包含4或5對重復(fù)探針，將芯片與生物素化的DNA片段雜交后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素來產(chǎn)生信號。Taitt等[38]通過該芯片對多種腹瀉致病菌的耐藥基因進行檢測，在2株志賀菌中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的qnrS基因，同時檢測到頭孢耐藥志賀菌株中的blaCTX-M-9和blaCTX-M-1基因。

5.全基因組測序法（WGS）

WGS可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，在定義耐藥基因型和預(yù)測耐藥表型具有很高的靈敏度和特異性。通過WGS進行生物信息學(xué)分析構(gòu)建進化樹，可對細菌基因組學(xué)與傳播模式進行精確研究。通過WGS識別耐藥基因常采用二代測序方法，形成短讀序列片段以后，使用定制算法將片段映射到參考序列以確定是否存在耐藥基因，耐藥基因的參考序列可在CARD或NCBI等數(shù)據(jù)庫中獲得[39]。Baker等[17]通過全基因組測序的方法，對福氏志賀菌3a型進行譜系與耐藥基因研究，所有的分離株均攜帶一個共同的多藥耐藥元件（SRL-MDRE），而MSM相關(guān)譜系中發(fā)現(xiàn)了額外的耐藥相關(guān)可移動遺傳元件，編碼了對其他抗菌藥物的耐藥性。Mook等[40]對英國發(fā)現(xiàn)的志賀菌分離株183660進行WGS后，發(fā)現(xiàn)在p183660質(zhì)粒上存在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）基因TEM-1和CTX-M，使該分離株獲得對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的高水平耐藥性。

三、展望

志賀菌對各種抗菌藥物的耐藥性不斷增加，對其耐藥基因與突變位點的研究與檢測尤為重要，根據(jù)目前已知的耐藥基因?qū)χ举R菌進行檢測，有助于對志賀菌感染的有效治療提供依據(jù)。在耐藥基因檢測方面，可根據(jù)實驗室條件選擇PCR法、DNA微陣列技術(shù)和全基因組測序法，在檢測志賀菌感染同時進行耐藥基因檢測。在未來，隨著檢測技術(shù)的不斷更新，有望研究出更多低成本、操作簡便的耐藥基因檢測技術(shù)，進一步實現(xiàn)對志賀菌的有效防控。

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