3種不同抑菌性的耳用制劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證及應(yīng)用

金文麗 王艷 隆旭紅 劉光斌 謝靜

摘要：目的探索3種不同抑菌性的耳用制劑微生物限度檢查方法。方法依據(jù)2015版《中國(guó)藥典》第四部通則1105、1106及1107中，需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)及控制菌的檢查法做驗(yàn)證。結(jié)果微生物計(jì)數(shù)法驗(yàn)證試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的5種添加菌回收比值均在0.5—2限度內(nèi);控制菌均能被檢出。結(jié)論通過(guò)對(duì)3種不同抑菌性的耳用制劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證，建立的3種不同的檢查法，能夠保證檢驗(yàn)結(jié)果的正確可信。

關(guān)鍵詞：微生物限度檢查;方法驗(yàn)證;耳用制劑

中圖分類號(hào)：R927.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

藥品的微生物限度檢查是藥品安全性檢驗(yàn)的重要指標(biāo)之一，按照《中國(guó)藥典》2015年版四部規(guī)定，供試品進(jìn)行微生物限度檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)對(duì)供試品的微生物計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法進(jìn)行適用性驗(yàn)證，以確證所建立的方法能用于該產(chǎn)品的菌落計(jì)數(shù)和控制菌檢驗(yàn)。本文中3種耳用制劑均為酒鋼醫(yī)院生產(chǎn)的院內(nèi)制劑，在進(jìn)行微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，由于抑菌性強(qiáng)弱不同，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終采用三種不同的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，非常具有代表性。

1儀器與材料

1.1儀器

Alphaclean 1300型超凈工作臺(tái)（力康精密科技）、HFsafel200LC型生物安全柜（上海力申）、HPX-Ⅲ-300型生化箱（上海躍進(jìn)）、HMX-Ⅲ-300型霉菌箱（上海躍進(jìn)）、LMQ.C-100EP型立式滅菌鍋（山東·新華醫(yī)藥器械股份有限公司）、Htysteritest601型集菌儀（杭州·泰林生物）、一次性薄膜過(guò)濾器（批號(hào)：2019111101）等。

1.2試驗(yàn)菌種

（1）金黃色葡萄球菌[cMCC（B）26003];（2）枯草芽孢桿菌[cMCC（B）63501];（3）銅綠假單胞菌[cMCC（B）10104];（4）白色念珠菌[CMCC（F）98001];（5）黑曲霉[CMCC（F）98003];均從中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院購(gòu)得。

1.3培養(yǎng)基

（a）胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（190729）、（b）胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（190813）和（c）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（190826），均由北京陸橋生產(chǎn);（d）pH7.0無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液（20190604）、（e）沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（20180714）、（f）甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（20180305）和（g）溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（20180402），均由青島海博生物公司生產(chǎn)。上述培養(yǎng)基均按藥典要求進(jìn)行了適應(yīng)性試驗(yàn)。

1.4供試品

硼酸滴耳液（批號(hào)：201908142，201908145，201908147）;碳酸氫鈉滴耳液（批號(hào)：201907182，201907183，201907185）;氯霉素滴耳液（批號(hào)：201908193，201908194，201908195），以上樣品均為酒鋼醫(yī)院藥學(xué)部生產(chǎn)。

2方法與結(jié)果

2.1菌懸液的制備

取1.2項(xiàng)下菌種（1）金黃色葡萄球菌、（2）枯草芽孢桿菌、（3）銅綠假單胞菌的新制培養(yǎng)物至（a）胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，33℃C培育18—24h，以（d）pH7.0氯化鈉一蛋白胨緩沖液按照10倍逐級(jí)稀釋制備l mL含菌量10³—10⁴、10²一10³、0—10²cfu的菌懸液;接種（4）白色念珠菌的新培養(yǎng)物至（e）培養(yǎng)基中，23℃培育1—2天，以0.9%氯化鈉無(wú)菌液按照10倍逐級(jí)稀釋制備lmL含菌量10³—10⁴、10²一10³、0—10²cfu的菌懸液;以適量（5）黑曲霉的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至（c）培養(yǎng)基試管斜面，23℃培育5—7d，滴加3—5mL 0.9%氯化鈉無(wú)菌液，以洗脫孢子，濾出孢子菌懸液（以紗布過(guò)濾菌絲）至滅菌的試管里，以0.9%氯化鈉無(wú)菌液按照10倍逐級(jí)稀釋制備lmL含孢子數(shù)10³—10⁴、10²—10³、O一10²cfu的孢子菌懸液。需氧菌計(jì)數(shù)用（1）、（2）、（3）、（4）和（5）作為試驗(yàn)菌;霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)用（4）和（5）作為試驗(yàn)菌;控制菌的試驗(yàn)菌株為（1）和（3）。所有菌種均為第3代。

2.2供試液的制備

用上述供試品各10mL，分別加到無(wú)菌錐形瓶?jī)?nèi)，再加（d）緩沖液至100mL，混勻，制成1：10的供試液。驗(yàn)證試驗(yàn)分3次獨(dú)立完成，其試驗(yàn)組分別采用上述供試品平行做3次。

2.3微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1需氧茵總數(shù)

（1）平皿法

試驗(yàn)組：取碳酸氫鈉滴耳液1：10的供試液各9.9mL，依次加到5支無(wú)菌試管內(nèi)，加入1mL含10³—10⁴cfu菌量的各試驗(yàn)菌菌懸液0.1mL，使含菌量不超過(guò)100cfu，混勻，吸取1mL，加到無(wú)菌平皿中。傾注約20mL的（a）培養(yǎng)基，輕輕混合均勻，置凝，33℃培育3—5d，每種菌液注2皿，計(jì)試驗(yàn)組菌數(shù)。

（2）培養(yǎng)基稀釋法

試驗(yàn)組：硼酸滴耳液采用培養(yǎng)基稀釋法。方法同（1）項(xiàng)，不同之處是以1mL含菌量不超過(guò)100cfu的供試液，依次加到5個(gè)平皿中，即0.2mL·皿^-1，各菌液平行2組，1mL的5個(gè)平皿菌落數(shù)之和為試驗(yàn)組菌落數(shù)。

（3）薄膜過(guò)濾法

試驗(yàn)組：氯霉素滴耳液采取微孑L薄膜過(guò)濾法。取1：10供試液1mL，進(jìn)行薄膜過(guò)濾，用0.9%氯化鈉無(wú)菌液沖洗5次，每次100mL，于第5次時(shí)分別添加各試驗(yàn)菌（不超過(guò)100cfu）1mL，使每膜1：10樣液中所含有菌數(shù)不超過(guò)100cfu，過(guò)濾，取下薄膜，面向上貼在（a）培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，即為試驗(yàn)組菌落數(shù)。

2.3.2霉菌和酵母菌總數(shù)（平皿法）

（1）試驗(yàn)組：取上述各制劑的1：10供試品溶液各9.9mL，分置于2支無(wú)菌試管，再加人每mL含菌量為10³—10⁴cfu的試驗(yàn)菌懸液0.1mL，混勻，使含菌量不超過(guò)100cfu，取1mL，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，每菌注2皿，傾入約20mL的（c）培養(yǎng)基，輕輕混合均勻，置凝，23～C培育5—7天，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，即為試驗(yàn)組菌落數(shù)。按相同方法測(cè)定菌液組、樣品對(duì)照組及陰性對(duì)照組的菌數(shù)。

（2）供試品對(duì)照組：吸取1：10的樣品溶液，用（d）緩沖液替代菌液與各試驗(yàn)組同法操作。

（3）菌液對(duì)照組：?。╠）緩沖液替代供試液，同各試驗(yàn)組試驗(yàn)，添加各試驗(yàn)菌。

（4）陰性對(duì)照組：用同批配制、滅菌的（d）緩沖液1mL代替供試品，同各試驗(yàn)組試驗(yàn)。

2.3.3計(jì)算

需氧菌總菌落數(shù)、霉菌與酵母菌總菌落數(shù)回收比值計(jì)算公式：回收比值=（試驗(yàn)組平均菌數(shù)一樣品對(duì)照組平均菌數(shù)）÷菌液對(duì)照組平均菌數(shù)。

2.4控制菌檢查

2.4.1金黃色葡萄球菌

碳酸氫鈉滴耳液、硼酸滴耳液采用常規(guī)法。取“2.2”項(xiàng)下制備好的1：10樣液9.9mL和1mL含菌量為10³—10⁴cfu的（1）菌懸液0.1mL，使含菌量不超過(guò)100cfu，接種至100mL（b）培養(yǎng)基中，混勻，33℃培養(yǎng)24h;氯霉素滴耳液采用薄膜過(guò)濾法，取“2.2”項(xiàng)下制備好的1：10供試液10mL，用薄膜過(guò)濾，用0.9%氯化鈉液沖濾膜5次，每次100mL，沖到第5次時(shí)添加（1）菌懸液（不大于100cfu）1mL，過(guò)濾，取出濾膜，接入100mL（b）培養(yǎng)基中，混勻，33℃培育24h。將培養(yǎng)物在（f）平板上分離接種，33～C培養(yǎng)18—72h。

2.4.2銅綠假單胞菌

均采用常規(guī)法。取“2.2”項(xiàng)下制備好的1：10供試液9.9mL和每mL含菌量為10³—10⁴cfu的（3）菌懸液0.1mL，接種到100mL（b）培養(yǎng)基中，混勻，33℃培育24h。將此培養(yǎng)物在（g）培養(yǎng)基平板上分離接種，33℃培育18—72h。

2.5結(jié)果

依據(jù)藥典要求，計(jì)數(shù)方法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果判斷為回收比值應(yīng)在0.5—2范圍內(nèi);控制菌檢查適用性驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果判斷為應(yīng)能檢驗(yàn)出所添加陽(yáng)性菌的相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)特點(diǎn)。

2.5.1需氧菌總茵落數(shù)計(jì)數(shù)、霉菌與酵母茵總菌落數(shù)計(jì)數(shù)適用性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

如表1，表2結(jié)果表明，所采用的方法，各試驗(yàn)菌的回收比均在0.5—2之內(nèi)，陰性組未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，證明方法適用。

2.5.2控制菌檢驗(yàn)方法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

如表3，采用的方法及（b）培養(yǎng)基的體積，在兩種控制菌檢查的方法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)中，試驗(yàn)組能夠檢驗(yàn)出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)反應(yīng)特征，供試品比照組及陰性比照組未有菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明方法可行。

3討論

由于硼酸滴耳液制備工藝是用70%乙醇作為溶劑，有一定抑菌性，在進(jìn)行需氧菌總數(shù)測(cè)定試驗(yàn)過(guò)程中，先用平皿法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，（2）菌的回收比值小于0.5，故方法不可行。在采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，各試驗(yàn)組所加入的試驗(yàn)菌回收比值，都在0.5—2之內(nèi)，最終采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行檢驗(yàn)。

氯霉素滴耳液，屬于含抗生素類制劑，抑菌性較強(qiáng)，在采用平皿法進(jìn)行需氧菌總菌落數(shù)測(cè)定時(shí)，（1）和（2）菌均未被檢出，（3）菌的回收比值低于0.5，（4）和（5）菌回收比值在0.5—2限度內(nèi)，故平皿法不可行;再采用薄膜過(guò)濾法，用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次lOOmL，做驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，各添加的試驗(yàn)菌株回收比值都在0.5—2限度之內(nèi)，所以能采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢驗(yàn)。

反復(fù)參考各文獻(xiàn)，經(jīng)過(guò)多次方法驗(yàn)證試驗(yàn)，所用方法能明顯的去除或減少制劑中抑菌成分的干擾，從而使檢驗(yàn)方法正確，檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。