慢加急性肝衰竭不同預(yù)后患者血漿外泌體差異蛋白的生物信息學(xué)分析

焦 彥， 張 瑩， 時(shí)紅林， 盧 旺， 陳德喜， 陳 煜， 時(shí)紅波

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京市肝病研究所， 北京 100069；2 北京市肝炎與肝癌精準(zhǔn)醫(yī)療及轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心， 北京 100069；3 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病中心四科， 肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100069

慢加急性肝衰竭(ACLF)是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝功能失代償，其病死率為40%～60%[1]。ACLF與失代償性肝硬化的主要區(qū)別之一是肝再生潛能。一些ACLF患者雖然病情嚴(yán)重，但仍可通過(guò)肝再生存活[2]。因此，對(duì)ACLF患者開展肝再生評(píng)估，對(duì)于臨床治療選擇、預(yù)后判斷尤為重要。外泌體是一種直徑為30～100 nm的納米級(jí)脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物質(zhì)[3]。外泌體在多種肝臟疾病中發(fā)揮重要作用[4]。最新研究[5-7]表明，外泌體參與肝巨噬細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)以及肝細(xì)胞凋亡與增殖。ACLF時(shí)由于肝細(xì)胞大量壞死，肝臟來(lái)源的外泌體大量釋放至外周血中，因此血液中外泌體可以實(shí)時(shí)反映肝細(xì)胞的功能狀態(tài)，外泌體及其攜帶的蛋白質(zhì)有望成為ACLF臨床監(jiān)測(cè)的重要工具。本研究通過(guò)非標(biāo)記(Label-free)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)ACLF不同預(yù)后患者血漿外泌體蛋白進(jìn)行鑒定和定量分析，篩選差異蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)分析差異蛋白功能及生物學(xué)過(guò)程，為尋找ACLF預(yù)后判斷的血清學(xué)標(biāo)志物及進(jìn)一步探討發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 前瞻性選取2019年7月—10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院的住院確診的ACLF患者10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡16～65歲，性別不限，參考《肝衰竭診治指南(2018年版)》[8]明確診斷為ACLF。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)；合并嚴(yán)重心、腦、腎臟疾病及其他系統(tǒng)性疾病；合并惡性腫瘤或活動(dòng)性消化道出血；慢性肝衰竭；依從性差者。前瞻性入組病例，隨訪90 d，死亡或肝移植者納入肝移植/死亡組，存活者納入生存組。

1.2 主要儀器和試劑 尿素(Bio-Rad)，硫脲(Sigma-Aldrich)，蛋白定量染液(Thermo Scientific)，胰蛋白酶(AB Sciex)，超聲波細(xì)胞破碎儀(南京先歐儀器制造有限公司)，酶標(biāo)儀(Thermo，Multiskan MK3)，電泳系統(tǒng)(bio-rad)，高效液相色譜儀(Thermo Scientic，EASY-nLC 1000 System)，質(zhì)譜系統(tǒng)(Thermo，Q-Exactive)，超速離心機(jī)(Beckman，OptimaTMXPN-100)。

1.3 外泌體的分離 取外周血，經(jīng)3000 r/min離心10 min獲得血漿。血漿依次經(jīng)2000 rcf離心10 min去除死細(xì)胞，10 000 rcf、4 ℃離心30 min去除細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管，110 000 rcf、4 ℃離心70 min獲得外泌體。將獲得的外泌體懸浮于PBS溶液中，-80 ℃保存以備進(jìn)一步檢測(cè)。

1.4 蛋白的提取和酶解 采集患者靜脈血5 ml，離心，分離血清，采用超速離心法提取血漿外泌體。取樣品加入適量尿素顆?；靹?，50∶1加入蛋白酶抑制劑，超聲1 s，停1 s，累計(jì)10 s。140 00g離心30 min，提取上清液中的蛋白。BCA法測(cè)定患者蛋白水平。每例樣本取10 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色30 min，脫色直至背景清晰；將每塊膠切成1 mm3小塊兒，置于1.5 ml Eppendorf管中；用 200 μl雙蒸水洗2次，每次10 min；加考染脫色液50 mmol/L NH4HCO3與ACN(1∶1)，脫色15 min，雙蒸水洗，重復(fù)，直至脫色完全；加 ACN 100 μl脫水至膠粒變白，真空抽干10 min；加 10 mmol/L DTT(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，加 ACN 100 μl脫水至膠粒變白；加 55 mmol/L IAA(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，加 ACN 100 μl脫水至膠粒變白；依次用下列溶液進(jìn)行混懸清洗：雙蒸水、ACN、每次10 min；將 0.01 μg/μl胰蛋白酶工作液，每管加100 μl，讓酶液與膠粒充分接觸。待酶液被膠粒完全吸收，再加25 mmol/L NH4HCO3100 μl，37 ℃過(guò)夜；離心收集酶解上清液，置于另一個(gè)Eppendorf管中。真空凍干，-20 ℃保存。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集 本報(bào)告采用Orbitrap 質(zhì)譜采集液相-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MSMS)數(shù)據(jù)。配制流動(dòng)相 A 液(100%水、0.1%甲酸)和 B 液(100%乙腈、0.1%甲酸)。使用A相溶解粉末，4 ℃ 14 000g離心 20 min，取上清1 μg樣品進(jìn)樣，液質(zhì)檢測(cè)。液相色譜洗脫條件如表1所示。使用Q Exactive質(zhì)譜儀，Nanospray FlexTM(ESI)離子源，設(shè)定離子噴霧電壓為 2.1 kV，離子傳輸管溫度為250 ℃，質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，質(zhì)譜全掃描范圍為 m/z 300～1400，一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為70 000，C-trap 最大容量為3×106，C-trap 最大注入時(shí)間為 60 ms；選取全掃描中離子強(qiáng)度 TOP 20 的母離子使用高能碰撞裂解方法碎裂，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)，二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為17 500，C-trap最大容量為5×104，C-trap 最大注入時(shí)間為 80 ms，肽段碎裂碰撞能量設(shè)為 27%，生成質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)(.raw)。

表1 液相色譜洗脫條件

1.6 蛋白的鑒定和定量分析 Label-free的質(zhì)譜分析是由Q-Exactive型質(zhì)譜系統(tǒng)完成，產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件采用產(chǎn)MaxQuant軟件處理,并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量分析。以倍數(shù)調(diào)>1.2倍或下調(diào)>1.2倍且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白質(zhì)。

1.7 生物信息學(xué)分析 通過(guò)Uniprot的注釋信息對(duì)差異蛋白進(jìn)行基因功能(GO)注釋，通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)，對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能(GO)富集分析，利用R-3.5.1軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行層次聚類分析。

1.8 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：(2019)科研快審第(989)號(hào)。患者家屬知情并簽署同意書。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以M(P25～P75)表示，兩組間比較采用 Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 隨訪后納入生存組患者5例，肝移植/死亡組患者5例。兩組患者在性別、年齡方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2 蛋白鑒定和定量分析結(jié)果 共鑒定出4675個(gè)肽段，860種蛋白。通過(guò)定量分析，按照篩選標(biāo)準(zhǔn)共篩選出 116種差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白62種、下調(diào)蛋白54種。上調(diào)和下調(diào)最顯著的15種蛋白見表3、4 。

表3 (肝移植/死亡組)/生存組上調(diào)差異蛋白

表4 (肝移植/死亡組)/生存組下調(diào)差異蛋白

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果

為了更好地解釋和剖析兩組ACLF患者血漿外泌體差異蛋白譜，對(duì)血漿差異外泌體蛋白進(jìn)行注釋，同時(shí)完成生物信息學(xué)分析。

2.3.1 差異蛋白 GO 功能的富集分析結(jié)果 篩選出的 116 種差異蛋白主要參與免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖等重要的生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)還與細(xì)胞質(zhì)、胞膜外區(qū)、細(xì)胞膜、質(zhì)膜、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架、細(xì)胞液泡、核內(nèi)體等細(xì)胞組分密切相關(guān)，并具有金屬離子結(jié)合、受體結(jié)合、信號(hào)傳感器活動(dòng)等分子功能(圖1)。

注：CC，細(xì)胞組分；MF，分子功能；BP，生物學(xué)過(guò)程；條形圖右側(cè)為P值。圖1 差異蛋白 GO 功能的富集分析結(jié)果

2.3.2 差異蛋白互作分析 將組間血漿外泌體差異蛋白進(jìn)一步用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析，蛋白互作關(guān)系見圖2。結(jié)果表明，鑒定到的血漿外泌體差異蛋白中有38個(gè)差異蛋白被互作網(wǎng)絡(luò)覆蓋，表明具有較好的生物學(xué)聯(lián)系，少數(shù)游離于互作網(wǎng)絡(luò)之外蛋白可能由于功能相對(duì)獨(dú)立或者與其他蛋白互作的可信度不高導(dǎo)致。KEGG 通路分析表明，差異蛋白在氨基酸的生物合成這一通路中不僅顯著性最強(qiáng)，且富集的蛋白數(shù)目最多(圖3)。

注：紅色圈內(nèi)表示上調(diào)表達(dá)蛋白，綠圈內(nèi)表示下調(diào)表達(dá)蛋白。圖2 蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果

3 討論

非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)近年來(lái)成為重要的質(zhì)譜定量方法，MaxQuant是目前領(lǐng)先的蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量算法。本研究采用的最新一代的 Orbitrap 質(zhì)譜采集 LC-MSMS 數(shù)據(jù)，采用非標(biāo)記定量結(jié)合LC/MS質(zhì)譜技術(shù)找到差異表達(dá)的外泌體蛋白質(zhì)。與其他定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相比，Label-free方法的應(yīng)用范圍廣，可用于微量樣品分析，速度快，重復(fù)性好，但在進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)，低豐度蛋白不易檢測(cè)[9]。本研究共篩選出116 種外泌體差異蛋白，62種蛋白表現(xiàn)為上調(diào)、54種蛋白表現(xiàn)為下調(diào)。

在外泌體廣泛的生理作用中，以細(xì)胞間的信息交流以及物質(zhì)傳遞最為重要，外泌體含有豐富的蛋白質(zhì)分子：一類為非特異性的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)在所有外泌體中，例如細(xì)胞骨架蛋白、四跨膜蛋白(CD9、CD63)和熱休克蛋白家族等；另一類為非特異性蛋白，與外泌體的細(xì)胞來(lái)源相關(guān)，蛋白的含量可能會(huì)根據(jù)疾病狀態(tài)而波動(dòng)，例如B 淋巴細(xì)胞分泌的外泌體表面有 MHC-Ⅱ類分子；腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜帶大量腫瘤抗原，這類蛋白質(zhì)可能與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)[10-11]。

Ig是機(jī)體體液免疫應(yīng)答時(shí)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的免疫效應(yīng)分子，在機(jī)體抵抗外來(lái)病原體中發(fā)揮著重要的作用。Ig由重鏈(H鏈，分為γ、α、μ、δ、ε鏈)和輕鏈(L鏈，分為κ型和λ型)組成。ACLF發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志是過(guò)度炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為患者血清中促炎細(xì)胞因子水平明顯升高和免疫細(xì)胞活化標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)[12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，HBV-ACLF患者存在Ig升高、補(bǔ)體下降及T淋巴細(xì)胞損耗。Ig、補(bǔ)體和T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等免疫指標(biāo)的變化可反映體液免疫的應(yīng)答情況，對(duì)于判斷病情、評(píng)估預(yù)后及指導(dǎo)免疫治療具有重要意義[14]。本研究表明，外泌體中攜帶的Ig可能參與了ACLF的體液免疫，由于不同預(yù)后患者處在疾病和免疫反應(yīng)的不同階段，故表現(xiàn)為上調(diào)或下調(diào)。在診斷ACLF時(shí)，可考慮作為血清學(xué)標(biāo)志物。

在肝移植/死亡組上調(diào)的蛋白中，Drp1是蛋白質(zhì)發(fā)動(dòng)蛋白超家族的成員，由GTP酶和GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域組成，Drp1可作用于線粒體外膜誘導(dǎo)線粒體分裂，對(duì)線粒體的分裂有重大意義[15]。抑制Drp1對(duì)幾種肝損傷模型具有保護(hù)作用，包括由毒性試劑(千里光堿和鎘)誘導(dǎo)的肝毒性損傷[16-17]、酒精誘導(dǎo)的肝毒性損傷[18]、營(yíng)養(yǎng)性脂肪變性[19]和膽汁淤積性肝損傷的動(dòng)物模型[20]。Diaph1是formin蛋白家族的一員，參與多種以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的生物學(xué)過(guò)程，如偽足與細(xì)胞極性的形成、細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)等。研究[21-23]發(fā)現(xiàn)，Diaph1的基因突變與耳聾和巨血小板減少癥相關(guān)，并且癌細(xì)胞中Diaph1的表達(dá)水平與疾病的臨床分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Diaph1可使肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促使HSC分泌腫瘤促進(jìn)因子[24]。NCoR1被證明在再生或致癌過(guò)程中發(fā)揮獨(dú)特的作用，其參與脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸從頭合成[25]。ASL的缺乏則會(huì)導(dǎo)致慢性肝病和肝糖原代謝受損[26]。ACLF的病程中肝細(xì)胞的損傷和炎癥貫穿疾病的始終，ACLF患者血漿外泌體中的Drp1、Diaph1、NCoR1、ASL是否可以作為ACLF早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志物，尚需要做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

膜聯(lián)蛋白A6是膜聯(lián)蛋白家族的一員，是一種鈣依賴性磷脂酶結(jié)合蛋白，主要存在于嚙齒動(dòng)物肝細(xì)胞的質(zhì)膜。研究[27]發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A6存在于癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡中，通過(guò)穩(wěn)定激活FAK-YAP通路誘導(dǎo)胃癌耐藥。膜聯(lián)蛋白A6還可在肝切除的肝再生模型中通過(guò)影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響肝切除后小鼠的存活率。研究[28]發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A6基因敲除小鼠在部分肝切除后表現(xiàn)出較低的存活率，缺乏膜聯(lián)蛋白A6會(huì)損害小鼠丙氨酸依賴性糖異生和肝再生。這一發(fā)現(xiàn)與本研究中ACLF死亡組患者血漿外泌體中膜聯(lián)蛋白A6表達(dá)下調(diào)的趨勢(shì)一致。但是，對(duì)于裝載在外泌體中的膜連蛋白A6，其是否參與ACLF患者的肝再生及氨基酸合成代謝等生物過(guò)程，能否作為ACLF肝再生及預(yù)后判斷的血清學(xué)標(biāo)志物，仍需進(jìn)一步研究。

鐵蛋白在人體各組織中廣泛存在，目前被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)蛋白，其由 2 種不同的亞基構(gòu)成，分別為H鏈和L鏈，即鐵蛋白輕鏈(FTL)[29]，在血管形成、細(xì)胞增殖及免疫抑制中有重要作用[30]。鐵的過(guò)度沉積產(chǎn)生自由基，破壞肝細(xì)胞的細(xì)胞器造成肝細(xì)胞受損，并可協(xié)同病毒等外因作用引起肝功能異常、肝炎、肝硬化乃至肝癌[31]。FTL與慢性肝臟疾病密切相關(guān), 其表達(dá)水平不僅能體現(xiàn)肝損傷狀況，還能反映肝臟疾病的進(jìn)展情況[32]。研究[33]發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白在慢性肝病患者血清中的含量顯著高于健康人群，這主要與肝臟炎性反應(yīng)使鐵蛋白合成增加，同時(shí)肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致鐵蛋白釋放入血有關(guān)。但是，肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中鐵蛋白輕鏈的含量均高于健康人群，但不同肝病組之間的表達(dá)可見隨病情加重逐漸降低的趨勢(shì)。ACLF患者病程中確實(shí)可見鐵蛋白的代謝異常，本研究首次在ACLF患者血漿外泌體中檢測(cè)到鐵蛋白輕鏈，其可能參與了ACLF 發(fā)病過(guò)程，其水平可能反映了疾病的進(jìn)展，后續(xù)有待實(shí)驗(yàn)對(duì) FTL在慢性肝病中的表達(dá)進(jìn)行分析，更好地驗(yàn)證本研究結(jié)果。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)ACLF患者血漿外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，篩選出116種外泌體差異蛋白，通過(guò)生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與肝臟免疫及炎癥反應(yīng)、糖類和氨基酸代謝、肝細(xì)胞損傷及再生等信號(hào)通路密切相關(guān)，從而為尋找ACLF預(yù)后判斷的血清學(xué)標(biāo)志物及進(jìn)一步探討發(fā)病機(jī)制提供了參考依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：焦彥負(fù)責(zé)實(shí)施研究過(guò)程和采集整理數(shù)據(jù)；張瑩、盧旺負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)；時(shí)紅林負(fù)責(zé)技術(shù)或材料支持；陳德喜負(fù)責(zé)修訂論文；陳煜負(fù)責(zé)患者入組及標(biāo)本的收集整理；時(shí)紅波負(fù)責(zé)提出研究選題，設(shè)計(jì)研究方案以及修訂論文。