徐 汀，張亦菲，黃家鶯，張浩然，田 愷，華賢輝，曹 瑩

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

解熱鎮(zhèn)痛藥是一類能使患病的發(fā)熱動(dòng)物的體溫降至正常，并能緩解疼痛的藥物。這類藥物大多數(shù)對(duì)風(fēng)濕病和痛風(fēng)疼痛能減輕其癥狀，有一定抗炎作用，不易產(chǎn)生耐受性及成癮性[1]。但運(yùn)用不當(dāng)則不利于對(duì)患病動(dòng)物的診斷從而延誤病情，同時(shí)在中獸藥中非法添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物，導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)在不知情的狀況下使用也會(huì)導(dǎo)致很多不良反應(yīng)的產(chǎn)生[2]。因此急需一種穩(wěn)定，可靠的方法來(lái)監(jiān)測(cè)中獸藥液體制劑中非法添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物的現(xiàn)象。

中獸藥作為我國(guó)傳承千年的醫(yī)藥學(xué)組成之一，是我國(guó)防治畜禽疾病的有效藥劑， 具有很好的研究應(yīng)用價(jià)值[3]。而現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，許多中草藥有效成分中所含有的物質(zhì)，能夠制成的中獸藥制劑并用于動(dòng)物疫病的防控，均具有激活免疫細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)免疫作用，增強(qiáng)免疫功能；又有抗病毒、抗細(xì)菌、抗氧化、抗應(yīng)激及促生長(zhǎng)之作用等[4]。中藥液體制劑是按形態(tài)分類的一大類制劑, 系指中藥提取物分散在液體介質(zhì)中形成的可供內(nèi)服或外用的液態(tài)制劑[5-6]。隨著禁抗時(shí)代的到來(lái)，市場(chǎng)上對(duì)能夠替代抗生素類產(chǎn)品的需求越來(lái)越大，而此時(shí)對(duì)這類中獸藥的監(jiān)控也應(yīng)該得到更大的關(guān)注[7]。因此，本文選擇了中獸藥中的液體制劑，在參考了相關(guān)文獻(xiàn)后[8-9]，結(jié)合了非法添加檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)，建立了中獸藥液體制劑中非法添加對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林的HPLC-PDA檢測(cè)方法，為中獸藥中非法添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物的監(jiān)測(cè)提供了方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平：感量0.01 mg，AB265-S，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高效液相色譜儀：Waters e2695，配二極管陣列檢測(cè)器(PDA)，沃特世公司;純水機(jī)：Molatom 1810A，中國(guó)重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司;酸度計(jì)：PHS-3C 電位計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試藥 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品(Dr. Ehrenstorfer GmbH，批號(hào)為C15846000，含量99.9%)、安乃近對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100002-201607，含量94.5%)、氨基比林對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100503-200301，含量100%)、安替比林對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100508-201602，含量100%)；實(shí)驗(yàn)用水(電阻率>18 MΩ·bcm，符合GB/T6682一級(jí)用水的規(guī)定)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；供試品均來(lái)自抽檢樣品，為檢測(cè)合格的樣品：雙黃連口服液樣品(批號(hào)：180301)；雙黃連注射液樣品(批號(hào)20180107)；黃芪多糖注射液(批號(hào)：91801302)；益母多抗魚(yú)腥草注射液(批號(hào)：180426)；楊樹(shù)花注射液(批號(hào)：20180202)；柴胡注射液(批號(hào)：91906181)，魚(yú)腥草注射液(批號(hào)：20191001)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ S5 C18 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉3.0 g，加水1000 mL，用磷酸調(diào)pH值至6.5)和乙腈(84:16，V1:V2)；流速度：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μl；檢測(cè)器：二極管整列檢測(cè)器(PDA)，記錄229 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。取供試品溶液和對(duì)照品溶液在該色譜條件下進(jìn)樣分析，同時(shí)記錄色譜圖與光譜圖。

2.2 液體的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取供試品1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 分別取對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林對(duì)照品分別為58.68、50.73、55.80、60.40 mg 于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度線，搖勻，作為對(duì)照儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 對(duì)照品工作溶液 精密量取2 mL對(duì)照儲(chǔ)備溶液，置20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，濾液作為對(duì)照品工作溶液。另取上述四個(gè)對(duì)照品各2 mL，一同置于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋并定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，濾液作為混合對(duì)照品工作溶液。

2.2.4 建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液 以對(duì)照品工作溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液，建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3 供試品的測(cè)定 按照2.1的色譜條件及2.2的溶液制備方法，將供試品溶液和對(duì)照品工作溶液注入高效液相色譜儀。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即可得到對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林的含量。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液，將對(duì)乙酰氨基酚、氨基比林、安替比林用甲醇稀釋至10、12.5、25、50、100、200、500倍作為對(duì)照品溶液，安乃近則稀釋為至5、6.5、10、20、100、200、500倍作為對(duì)照品溶液。按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)來(lái)建立線性回歸方程，結(jié)果表明，對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林濃度分別在1.17～117.28、2.03～202.92、5.58～111.60、2.42～120.80 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。其線性關(guān)系分別為：

對(duì)乙酰氨基酚：y=42943x-5107.1,R2= 0.9986；安乃近：y=12590x-8787.7,R2= 0.9999；氨基比林：y=22107x-15671,R2= 0.9980；安替比林：y= 25211x-468.5,R2= 0.9993

2.5 專屬性考察 取中獸藥液體制樣品，按照上述2.2的制備方法制得空白基質(zhì)溶液。根據(jù)樣品使用方式選擇了比較有代表性的基質(zhì)復(fù)雜的雙黃連口服液和基質(zhì)比較簡(jiǎn)單的魚(yú)腥草注射液進(jìn)行專屬性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)所選擇的空白基質(zhì)溶液以及對(duì)照品工作溶液進(jìn)行專屬性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，空白基質(zhì)對(duì)四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物的出峰并沒(méi)有干擾，不影響對(duì)其含量的測(cè)定。典型圖譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 A為雙黃連口服液空白基質(zhì)溶液的色譜圖, B 為魚(yú)腥草注射液空白基質(zhì)溶液色譜圖

圖2 對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林濃度為0.1 mg/mL對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 對(duì)乙酰氨基酚(A)、安乃近(B)、安替比林(C)、氨基比林(D)的紫外光譜圖(0.1 mg/mL)

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果表明，對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林的峰面積RSD分別為0.66%、1.03%、0.03%、0.10%，說(shuō)明該儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，分別在0、1、6、9、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算峰面積RSD，對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林峰面積的RSD分別為0.99%、2.82%、0.18%、0.42%。結(jié)果表明，混合溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 檢測(cè)限 取中獸藥液體制劑 1 mL，逐級(jí)加入對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5、2、1和0.5 mL，制成對(duì)乙酰氨基酚、氨基比林、安替比林添加量分別為2.35、1.17、0.59 g/L；2.23、1.12、0.56 g/L; 2.42、1.21、0.60 g/L;安乃近添加量為2.54、2.03、1.01 g/L的添加樣品，同樣根據(jù)樣品使用方式選擇了比較有代表性的基質(zhì)復(fù)雜的雙黃連口服液和基質(zhì)比較簡(jiǎn)單的魚(yú)腥草注射液進(jìn)行檢測(cè)限的考察。按照2.1的色譜條件以及2.2的處理方法進(jìn)行測(cè)定?？紤]到非法添加的成分含量大都較高，故選擇光譜圖失真的最大濃度作為本方法的檢測(cè)限[10]。結(jié)果表明，對(duì)乙酰氨基酚、氨基比林、安替比林的檢測(cè)限分別為1.17 g/L、1.12 g/L、1.21 g/L，安乃近的檢測(cè)限為2.03 g/L。典型圖譜見(jiàn)圖4～圖8。

圖4 A、B 分別為魚(yú)腥草注射液中添加(1.17 g/L、2.03 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L)和(2.35 g/L、2.54 g/L、2.42 g/L、2.23 g/L)濃度的對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林

圖5 A、B 分別為雙黃連口服液中添加(1.17 g/L、2.03 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L)和 (2.35 g/L、2.54 g/L、2.42 g/L、2.23 g/L)濃度的對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林

圖6 魚(yú)腥草注射液中添加的對(duì)乙酰氨基酚、安替比林、氨基比林的光譜圖(1.17 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L)

圖7 雙黃連口服液中添加的對(duì)乙酰氨基酚、安替比林、氨基比林的光譜圖(1.17 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L)

圖8 為魚(yú)腥草注射液(A)和雙黃連口服液(B)中添加安乃近的光譜圖(2.03 g/L)

2.9 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 精密量取1.0 mL未檢出上述四種解熱鎮(zhèn)痛藥的供試品，置于100 mL容量瓶中，精密量取對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、1.0、1.0 mL，將其加入裝有供試品的100 mL容量瓶中。用甲醇稀釋定容，(添加水平：對(duì)乙酰氨基酚、安替比林、氨基比林為1.17 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L，安乃近為2.03 g/L)。每份供試品做5份平行樣，按照外標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，表明回收率良好。

表1 四種解熱鎮(zhèn)痛藥在不同中獸藥液體制劑中的回收率(n=5)

3 討論與結(jié)論

3.1 溶劑條件的選擇[11]在加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，考察了甲醇，乙腈，和流動(dòng)相分別稀釋樣品進(jìn)樣。結(jié)果表明，安乃近在用乙腈和流動(dòng)相稀釋的樣品中回收率較差，可能是安乃近有降解。本次實(shí)驗(yàn)選用的液體制劑中獸藥樣品都能在甲醇中溶解，口服液中有析出的物質(zhì)對(duì)回收率并無(wú)影響。綜上，相比于流動(dòng)相溶解，選擇甲醇作為溶劑可以減少安乃近的降解。

3.2 色譜條件選擇 參考了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2448號(hào)上收載的阿莫西林可溶性粉中非法添加加熱鎮(zhèn)痛類藥物檢查方法的色譜條件，以及其他文獻(xiàn)中的液相色譜條件[12-13]，上述條件中，都能較好的將對(duì)乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林分離。但考慮到中藥制劑中基質(zhì)復(fù)雜，為了能更好的將基質(zhì)中的雜質(zhì)和目標(biāo)峰分離，所以選擇磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉3.0 g，加水1000 mL，用磷酸調(diào)pH值至6.5)和乙腈(84∶16，V1∶V2)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min等度進(jìn)樣。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 農(nóng)業(yè)部公告 第2448號(hào)[10]上收載的阿莫西林可溶性粉中非法添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物檢查方法所選擇的吸收波長(zhǎng)為229 nm。故參考了該方法采取了229 nm作為定量波長(zhǎng)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)中獸藥液體制劑中非法添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物的這一方法，具有操作方便，定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。為中獸藥中非法添加解熱鎮(zhèn)痛類藥物的監(jiān)測(cè)提供了可靠的方法，為中獸藥產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)管提供了保障。