李 騰，周小蘭，褚 靜，王立芹，曹國芬，張海苗

產(chǎn)后抑郁癥(PPD)是一種常見的精神疾病，藥物治療和心理治療是PPD最常用的兩種治療方法，但是治療成功率低，效果不理想[1]。目前有研究[2]表明腸道微環(huán)境失調(diào)可能與焦慮、抑郁等心理疾病有關(guān)。因此腸道微生態(tài)與抑郁癥的關(guān)系也為PPD的治療提供新的思路。鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosus屬于乳桿菌屬，和雙歧桿菌都屬于目前公認(rèn)的益生菌[2]。有研究[3]表明，應(yīng)用鼠李糖乳桿菌對小鼠進(jìn)行體內(nèi)飼喂，能夠影響焦慮和抑郁樣行為。但鼠李糖乳桿菌與PPD之間關(guān)系的研究在國內(nèi)外少有報(bào)道。本研究采用地塞米松磷酸鈉建立PPD小鼠模型，初步探究鼠李糖乳桿菌對小鼠產(chǎn)后抑郁樣行為的影響，為產(chǎn)后抑郁的研究和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級成年C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量18～24 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。進(jìn)行為期一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，室溫24～27 ℃，濕度45%～50%，給予自然晝夜節(jié)律光照，動物可自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)的后3 d，對雌性小鼠進(jìn)行24 h食物消耗實(shí)驗(yàn)、黑白箱實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)，以此獲得行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的基線值。

1.2 動物模型制備 將雌雄小鼠按1∶1比例合籠交配，24 h后行陰道涂片檢測雌性小鼠是否懷孕。受孕雌鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分為鼠李糖乳桿菌干預(yù)低劑量組(Ⅰ組，n=5)、鼠李糖乳桿菌干預(yù)高劑量組(Ⅱ組，n=5)、陽性對照組(Ⅲ組，n=5)、模型對照組(Ⅳ組，n=5)。為了排除注射對母鼠產(chǎn)生的影響,Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠自受孕第1天開始，皮下注射1 mL·kg-1·d-10.9%氯化鈉溶液，共注射14 d，使其在后期接受地塞米松注射時(shí)對注射這一操作適應(yīng),避免操作引起的差異。受孕第15天開始，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠皮下注射0.2 mg·kg-1·d-1地塞米松磷酸鈉，直至23 d左右產(chǎn)崽?？瞻讓φ战M(Ⅴ組，n=5)小鼠自然飼養(yǎng)。

1.3 干預(yù)方法 產(chǎn)后通過灌胃給藥的方式進(jìn)行干預(yù)，Ⅰ組和Ⅱ組小鼠分別給予1×107CFU/(kg·d)和1×108CFU/(kg·d)鼠李糖乳桿菌,Ⅲ組小鼠給予1.8 mg·kg-1·d-1帕羅西汀，Ⅳ組和Ⅴ組小鼠給予等量的0.9%氯化鈉溶液，干預(yù)時(shí)間為4周。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 24 h食物消耗實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開始前動物需禁食禁水24 h，然后每只小鼠給予足量準(zhǔn)確稱量的普通飼料，24 h后稱量剩余飼料重量，同時(shí)稱動物體質(zhì)量。計(jì)算24 h攝食量，公式為：攝食量=(食物總量-食物余量)/體質(zhì)量×100%。記錄每周體質(zhì)量變化，體質(zhì)量變化率=(本周體質(zhì)量-第一周體質(zhì)量)/本周體質(zhì)量。

1.4.2 黑白箱實(shí)驗(yàn) 黑白箱是一個(gè) 50 cm×30 cm×30 cm 的樹脂板盒子，由占 1/3 體積的不透明黑箱(有蓋，30 cm×20 cm×30 cm)和占2/3體積的透明白箱(無蓋，30 cm×30 cm×30 cm)組成，在黑箱與白箱相連壁的底部正中有個(gè)小的門洞(5 cm×7 cm)，小鼠可從該門穿梭于兩箱，每次將小鼠放入黑箱同一位置內(nèi)，并由攝像頭記錄小鼠5 min內(nèi)在白箱停留的時(shí)間以及在兩箱穿梭的次數(shù)。

1.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將小鼠放入玻璃燒杯中，水溫保持在25～27 ℃。攝像頭檢測 6 min，在小鼠游泳2 min 后，記錄接下來4 min內(nèi)小鼠的不動性的累計(jì)時(shí)間:即小鼠在水中放棄掙扎，呈直立漂浮狀態(tài)，或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動以保持頭部浮在水面的持續(xù)時(shí)間總和。

1.4.4 懸尾實(shí)驗(yàn) 用膠帶將小鼠懸掛于距離臺面 50 cm 的支架邊緣上，膠帶粘貼位置距小鼠尾尖1～2 cm 處，腹部對準(zhǔn)攝像頭，攝像記錄 6 min，統(tǒng)計(jì)最后 4 min 小鼠靜止不動的累計(jì)時(shí)間:即小鼠放棄掙扎，呈僵直狀態(tài)，或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動的持續(xù)時(shí)間總和。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組24 h食物消耗和體質(zhì)量變化率比較 攝食量均下降，造模后變化則較平穩(wěn)。與造模前相比，造模后和干預(yù)后各組小鼠攝食量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同組別間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。體質(zhì)量變化率呈上升趨勢，與造模前相比，造模后和干預(yù)后各組小鼠體質(zhì)量變化率明顯增加(P<0.01)；與造模后相比，干預(yù)后各組小鼠體質(zhì)量變化率增加(P<0.05)(見表1、2)。

2.2 各組黑白箱實(shí)驗(yàn)行為評估 造模前各組小鼠的白箱停留時(shí)間和黑白箱穿梭次數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后與Ⅴ組相比，其余組小鼠的白箱停留時(shí)間降低，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，黑白箱穿梭次數(shù)有所減少(P<0.05)。干預(yù)后黑白箱穿梭次數(shù)各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Ⅴ組比較，其余組的白箱停留時(shí)間減少但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3、4)。

表1 各組24 h食物消耗實(shí)驗(yàn)攝食量比較

表2 各組體質(zhì)量變化率比較

表3 各組黑白箱實(shí)驗(yàn)行為評估(白箱停留時(shí)間)

2.3 各組強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)情況 造模前各組小鼠的懸尾不動時(shí)間和不動狀態(tài)持續(xù)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模結(jié)束后各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試，與Ⅴ組相比，其余組小鼠懸尾不動時(shí)間明顯升高(P<0.01)。干預(yù)后與Ⅴ組比較，其余組小鼠的懸尾不動時(shí)間增加(P<0.01)；與Ⅳ組比較，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的懸尾不動時(shí)間減少(P<0.01)。與造模前相比，造模后和干預(yù)后Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠強(qiáng)迫游泳不動持續(xù)時(shí)間和懸尾不動時(shí)間增加(P<0.05)；與造模后相比，干預(yù)后Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組小鼠強(qiáng)迫游泳不動持續(xù)時(shí)間和懸尾不動時(shí)間減少(P<0.05)(見表5、6)。

表4 各組黑白箱實(shí)驗(yàn)行為評估(黑白箱穿梭次數(shù))

表5 各組強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動狀態(tài)持續(xù)時(shí)間比較

表6 各組懸尾實(shí)驗(yàn)不動時(shí)間比較

3 討論

PPD是最常見的產(chǎn)褥期精神綜合征之一，伴隨著發(fā)病率的升高，越來越受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界普遍重視。然而在基礎(chǔ)研究中，目前還沒有較為完善的PPD動物模型。孕期皮質(zhì)酮法、母嬰分離法或模擬妊娠后激素停撤方案等，這些方法在發(fā)病原因和臨床表現(xiàn)等方面與臨床PPD有一定差異[4]。近年來，有學(xué)者發(fā)展轉(zhuǎn)基因抑郁動物模型(Wistar Kyoto 大鼠和Flinder Resistant Line 大鼠)[5]，這類PPD模型雖然較穩(wěn)定，但又難以獲得。GREGUS等[6]通過長期反復(fù)高劑量地塞米松注射成功誘導(dǎo)出PPD動物模型，本研究根據(jù)GREGUS等的研究設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，自然分娩后建立穩(wěn)定可靠的PPD動物模型，并對其進(jìn)行行為學(xué)測試評估。

體質(zhì)量增長情況能從宏觀上反應(yīng)小鼠的抑郁狀態(tài)[7]。鼠李糖乳桿菌的干預(yù)能減緩小鼠產(chǎn)后體質(zhì)量增長率下降，各時(shí)相點(diǎn)相比，各組小鼠體質(zhì)量變化率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與體質(zhì)量本身變化有關(guān)。24 h攝食量變化較平穩(wěn)，呈整體下降趨勢，組間差異不顯著，可能該評價(jià)指標(biāo)對PPD動物模型不太敏感。

黑白箱實(shí)驗(yàn)利用動物趨暗避光本能和探索本能對動物進(jìn)行行為學(xué)評估[8]。造模后Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠白箱停留時(shí)間減少，干預(yù)后Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組小鼠白箱停留時(shí)間有所增加，提示鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)后抑郁小鼠的行為有一定影響。造模結(jié)束后除Ⅴ組外，其余組小鼠白箱停留時(shí)間明顯減少，黑白箱穿梭次數(shù)也有所減少但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而鼠李糖乳桿菌干預(yù)能增加抑郁小鼠白箱停留時(shí)間，但對于黑白箱穿梭次數(shù)影響不大，可能需要其他的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)幫助鑒定。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)都是利用動物的“行為絕望狀態(tài)”，衡量其抑郁情緒，也是常用的檢測抑郁行為的方法[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌干預(yù)后，抑郁小鼠不動狀態(tài)持續(xù)時(shí)間和懸尾不動時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)后抑郁小鼠的情緒有一定影響。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組組間比較，各指標(biāo)變化不顯著(P>0.05)，表明鼠李糖乳桿菌和帕羅西汀有類似的抗抑郁效果。Ⅰ組和Ⅱ組小鼠各指標(biāo)比較差別也不明顯，表示鼠李糖乳桿菌的低劑量和高劑量對各指標(biāo)的影響差異不大。

近年來，越來越多的研究將腸道微生物群與大腦的神經(jīng)反應(yīng)通過多種雙向途徑(微生物群-腸-腦軸)聯(lián)系起來，腸-腦軸也引起了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)，抑郁癥宿主的腸道菌群與健康對照組比較，都發(fā)生了明顯改變[10]。焦慮或抑郁等心理疾病可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)，本研究選用鼠李糖乳桿菌作為干預(yù)用物。鼠李糖乳桿菌是革蘭氏陽性益生菌，存在于人和動物的腸道內(nèi)，屬于目前公認(rèn)的益生菌。本研究結(jié)果提示，鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)后抑郁小鼠的行為學(xué)有一定影響，但具體的作用機(jī)制還不十分明了。

以往研究[11]表明，腸道微生物比例失調(diào)引起機(jī)體抑郁情緒，其可能的機(jī)制包括：機(jī)體炎癥反應(yīng)學(xué)說，腸道菌群失調(diào)，有害物質(zhì)增多，激活免疫系統(tǒng)，使得機(jī)體炎癥反應(yīng)明顯，產(chǎn)生一系列免疫因子的釋放和應(yīng)答，影響腸系神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)而導(dǎo)致腦部功能的紊亂，使機(jī)體情緒和行為發(fā)生相應(yīng)變化，引發(fā)抑郁癥[12]。此外，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的改變，益生菌能產(chǎn)生多種神經(jīng)遞質(zhì)，比如5-羥色胺、去甲腎上腺素等，它們能與宿主相互作用，從而影響大腦的功能[13]。這些神經(jīng)遞質(zhì)代謝水平失衡會導(dǎo)致病人精神活動和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異常。研究[14]表明，用鼠乳桿菌喂食無菌焦慮和抑郁樣小鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)GABA受體表達(dá)會增加，GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個(gè)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA 信號障礙通常都會與抑郁和焦慮相關(guān)聯(lián)。但對于臨床PPD而言，PPD與生理、心理和環(huán)境等諸多因素相關(guān)，鼠李糖乳桿菌是否影響抑郁樣小鼠腸道菌群和神經(jīng)遞質(zhì)的變化，這都將是我們課題組繼續(xù)探索和研究的方向。