張華文，楊 立，任琛琛，張 峰，李飛燕，陸 杰，楊 靖，喬明靜

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450052)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是一種常見的婦科疾病,組織學(xué)上表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜基質(zhì)和腺體在子宮外生長,發(fā)病率在育齡期婦女中約占5%～10%,在不孕婦女中可達(dá)50%，在慢性盆腔痛婦女中為50%～60%[1,2]。EMs的發(fā)生與多種遺傳和環(huán)境因素有關(guān),該疾病的遺傳度可達(dá)50%[3]。脂聯(lián)素(adiponectin，ADIPOQ)是最豐富的血漿脂肪因子,主要來源于白色脂肪組織。最初ADIPOQ被認(rèn)為是重要的脂質(zhì)代謝和能量消耗的調(diào)節(jié)劑,但是越來越多的證據(jù)表明ADIPOQ可通過影響巨噬細(xì)胞極化及激活JAK/STAT3信號(hào)并激活A(yù)MPK通路發(fā)揮抑制血管生成、抗炎和促凋亡的作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，EMs患者血清及腹腔液中脂聯(lián)素表達(dá)降低,但目前尚無脂聯(lián)素單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)與EMs的相關(guān)報(bào)道。本文采用飛行時(shí)間質(zhì)譜分析法對(duì)河南地區(qū)漢族女性ADIPOQ基因多態(tài)性與EMs發(fā)病相關(guān)性進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年3月至2019年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院住院且經(jīng)腹腔鏡及病理確診的內(nèi)異癥患者282例,根據(jù)美國生育學(xué)會(huì)分類(1985年)進(jìn)行分期。選擇同期因輸卵管積水、卵巢單純性囊腫、畸胎瘤行腹腔鏡檢查或腹腔鏡手術(shù),排除EMs及子宮腺肌病的271例患者為對(duì)照組。兩組均為無血緣關(guān)系的河南籍漢族育齡期婦女,且均在原籍穩(wěn)定居住3代以上,均無內(nèi)異癥家族遺傳史及其他遺傳病,排除其他內(nèi)外科及內(nèi)分泌疾病,3個(gè)月內(nèi)無服用激素類藥物及抗代謝類藥物史。EMs組與對(duì)照組的年齡[(34.15±5.8)歲 vs (33.13±5.5)歲]、BMI[(23.8±2.8)kg/m2vs (24.0±2.9)kg/m2]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究患者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因組DNA 采集外周靜脈血2mL,EDTA抗凝,使用全血基因組DNA提取試劑盒(Sangon Biotech公司,中國上海)提取基因組DNA。用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司,美國)檢測(cè)DNA純度,確保A260和A280比值為1.8～2.0,經(jīng)1.25%瓊脂糖凝膠電泳儀進(jìn)行質(zhì)檢合格,置于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因SNP位點(diǎn)的選擇 基于gnomAD數(shù)據(jù)(https://macarthurlab.org/2018/10/17/gnomad-v2-1/)和以前文獻(xiàn)報(bào)道,優(yōu)先選擇已證實(shí)功能相關(guān)的SNP并保證在東亞人口中最小等位基因頻率(minimum allele frequency,MAF)>0.01。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)合成 結(jié)合文獻(xiàn)并采用Assay Design 3.1軟件(Agena公司,美國)設(shè)計(jì)PCR引物和單堿基延伸引物(均由北京博淼生物技術(shù)有限公司合成),PCR引物序列見表1。

表1 4個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.4 PCR擴(kuò)增 每個(gè)反應(yīng)總體積5μL,水1.85μL,10×PCR緩沖液0.625μL(含15mmol/L MgCl2),MgCl2(25mmol/L)0.325μL,dNTP(25mmol/L each,Agena公司,美國)0.1μL,HotStar Taq (5U/μL,Agena公司,美國)0.1μL,每條擴(kuò)增引物(500mmol/L each,Agena公司,美國)1.0μL,DNA樣本(20ng/μL)1μL。反應(yīng)條件:94℃ 5min;94℃ 20s,56℃ 30s,72℃ 1min,45個(gè)循環(huán)；72℃ 3min；冷卻至4℃。加2μL蝦堿性磷酸酶(SAP)去除體系中多余的dNTP,反應(yīng)體系7μL,其中PCR產(chǎn)物5μL,10×SAP緩沖液(New England Biolabs公司,美國)0.17μL,SAP酶(1U/μL)0.30μL,水1.53μL,反應(yīng)條件：37℃ 20min；85℃ 5min；4℃。

1.2.5 單堿基延伸 總反應(yīng)體積9μL,包含PCR純化產(chǎn)物7μL,水0.619μL,10×iPLEX緩沖液0.2μL,終止混合物0.2μL,延伸引物0.940μL,iPLEX酶(Ge Healthcare公司,美國)0.041μL,再次進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:94℃ 30s；94℃ 5s；52℃ 5s,80℃ 5s內(nèi)部5個(gè)循環(huán),持續(xù)外部40個(gè)循環(huán)；72℃ 3min,冷卻至4℃。反應(yīng)結(jié)束后每份延伸反應(yīng)產(chǎn)物均加入6mg陽離子交換樹脂(Ge Healthcare公司,美國)脫鹽純化。

1.2.6 芯片點(diǎn)樣及質(zhì)譜檢測(cè) 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)通過將分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)激光激發(fā)，不同荷質(zhì)比的核酸分子在電場(chǎng)中飛行時(shí)間不同，通過檢測(cè)到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間獲得分析物的分子量，特點(diǎn)是具有極高的精確度和靈敏度，適用于低量樣本檢測(cè)。使用MassARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣儀(Agena公司,美國),將純化后的延伸產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP芯片(Agena公司,美國)上,使用MassARRAY Analyzer 4.0質(zhì)譜儀(Agena公司,美國)檢測(cè),運(yùn)行MassARRAY TYPER 4.0軟件(Agena公司,美國),根據(jù)質(zhì)譜峰圖得出SNP分型數(shù)據(jù)。位點(diǎn)檢出率大于99%，隨機(jī)選擇10%的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)基因分型檢測(cè),得出重復(fù)樣品的一致性率大于98%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS22.0軟件雙側(cè)t檢驗(yàn)比較病例組與對(duì)照組年齡、BMI的差異。采用χ2檢驗(yàn)評(píng)估對(duì)照組中基因型頻率是否偏離了Hardy-Weinberg平衡(HWE)；使用非條件logistic回歸模型計(jì)算了比值比(odds ratios,ORs)及95%置信區(qū)間(confidence intervals,CIs)對(duì)ADIPOQ基因多態(tài)性和EMs風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系進(jìn)行了評(píng)估；將EMs患者按臨床分期、CA125水平、有無痛經(jīng)或有無不孕史進(jìn)行分層分析；以上均利用PLINK 1.90軟件完成。使用Haploview 4.1軟件評(píng)估各位點(diǎn)間的連鎖不平衡(LD)及單倍體型頻率,雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SNP連鎖不平衡分析 將r2>0.80視為強(qiáng)連鎖不平衡,軟件計(jì)算結(jié)果顯示,rs822395、rs17366568、rs2241766和rs1501299四個(gè)位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖現(xiàn)象，見圖1。

圖1 ADIPOQ基因中四個(gè)位點(diǎn)的連鎖不平衡分析

2.2 ADIPOQ基因SNP位點(diǎn)在EMs組和對(duì)照組中的多態(tài)性分布 各SNP位點(diǎn)的基因型分布均符合HWE(P>0.05)，表明研究對(duì)象具有群體代表性。ADIPOQ rs2241766位點(diǎn)GG基因型與EMs發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān),經(jīng)年齡和BMI校正后,其致EMs效應(yīng)是TT基因型的0.71倍(P=0.040,OR=0.71,95%CI=0.51～0.98)。校正年齡和BMI后,rs2241766的加性模型(P=0.014,OR=0.71,95%CI=0.55～0.93)和顯性模型(P=0.026,OR=0.68,95%CI=0.48～0.95)均與EMs有關(guān)。這進(jìn)一步表明rs2241766位點(diǎn)的突變型等位基因G可能為EMs的保護(hù)因素,且這種保護(hù)作用隨著等位基因G的數(shù)目增加而有增加的趨勢(shì)。rs1501299基因型分布頻率在兩組間亦有一定的差異(加性模型:校正后P=0.050,OR=0.75,95%CI=0.57～1.00),提示rs1501299位點(diǎn)的T突變可能為EMs發(fā)生的保護(hù)因素,而其他兩個(gè)位點(diǎn)rs822395和rs17366568未觀察到與EMs的關(guān)聯(lián)性(P>0.05)，見表2。

表2 ADIPOQ基因型多態(tài)性和EMs危險(xiǎn)關(guān)系的logistic回歸模型分析[n(%)]

*P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3 ADIPOQ基因SNP位點(diǎn)在EMs患者中的分層分析 經(jīng)年齡和BMI校正后,rs2241766位點(diǎn)GT+GG基因型與TT基因型EMs患者相比高CA125水平、痛經(jīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低(P=0.003,OR=0.40,95%CI=0.21～0.73和P=0.023,OR=0.55,95%CI=0.32～0.93),同樣III～I(xiàn)V期EMs患者更多為rs2241766 TT基因型攜帶者(P=0.026),有不孕史EMs患者與無不孕史者比攜帶TT基因型頻率更高(56.0 vs 48.4%),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.091)?？梢妑s2241766位點(diǎn)的等位基因G突變可能為EMs患者高CA125水平、痛經(jīng)甚至是不孕的保護(hù)因素。rs1501299位點(diǎn)攜帶T等位基因的(GT+TT)基因型為EMs患者高CA125水平、不孕發(fā)生的保護(hù)因素(P=0.020,OR=0.49,95%CI=0.27～0.89和P=0.039,OR=0.60,95%CI=0.37～0.97),rs1501299位點(diǎn)的GG基因型在III～I(xiàn)V期EMs患者中頻率更高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.080)。rs822395和rs17366568位點(diǎn)基因型頻率亦與EMs臨床分期、CA125水平、有無痛經(jīng)、有無不孕史無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 ADIPOQ基因型與EMs易感性的分層分析[n(%)]

續(xù)表3

3 討 論

ADIPOQ基因由16kb堿基組成,包含3個(gè)外顯子及2個(gè)內(nèi)含子,與編碼膠原VIII、膠原X、TNF和補(bǔ)體因子C1q的基因同源。脂聯(lián)素與其特殊受體(AdipoR1、AdipoR2和T-鈣黏蛋白)結(jié)合,并通過AMPK、mTOR、NF-κB、STAT3和JNK等多種途徑啟動(dòng)激活多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),在調(diào)節(jié)激素水平、炎癥反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞增殖與凋亡和纖維化等過程中均發(fā)揮重要作用。

有研究表明,EMs患者的血清脂聯(lián)素水平降低,晚期EMs患者腹膜液中脂聯(lián)素水平顯著降低,而循環(huán)血漿脂聯(lián)素水平很大一部分(30%～70%)受遺傳學(xué)的影響。本研究選擇了與癌癥或炎癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的4個(gè)SNP進(jìn)行了分析。先前研究表明，rs2241766位點(diǎn)攜帶G等位基因可增加循環(huán)血漿中脂聯(lián)素水平，并降低乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)[5]。此外，Cui等[6]研究中，對(duì)于接受手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌患者,rs2241766 TT+GT基因型攜帶者的總生存率低于GG基因型攜帶者。推測(cè)rs2241766的G突變發(fā)揮抑癌作用可能與ADIPOQ分泌增加，從而抑制新生血管生成和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，rs2241766位點(diǎn)的純和突變GG基因型在EMs患者中頻率明顯降低，提示ADIPOQ基因突變可能影響異位內(nèi)膜的侵襲與種植。rs2241766位于外顯子2可導(dǎo)致同義的Gly15Gly變化,且與位于ADIPOQ 3'-UTR的rs2082940、rs4686803位點(diǎn)具有強(qiáng)連鎖關(guān)系，靶基因3'-UTR的遺傳變異可能影響miRNA的結(jié)合和miRNA的穩(wěn)定性。因此,該位點(diǎn)的G突變可能影響剪接并修飾基因的表達(dá),提高ADIPOQ mRNA及ADIPOQ水平，進(jìn)而誘導(dǎo)AMPK磷酸化及調(diào)控其下游通路在EMs的發(fā)展中發(fā)揮保護(hù)作用，但該假設(shè)需在細(xì)胞和動(dòng)物模型中進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。

另一個(gè)在ADIPOQ研究中經(jīng)常被基因分型的SNP是rs1501299，rs1501299位于內(nèi)含子2,與調(diào)控ADIPOQ mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的表達(dá)數(shù)量性狀基因座(expression quantitative trait Loci，eQTL)相關(guān)，最近的meta分析推測(cè)rs1501299與ADIPOQ基因尚未識(shí)別的3'非翻譯區(qū)(UTR)的功能變異區(qū)存在連鎖不平衡,并且該內(nèi)含子中可能包括順式作用RNA元件、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子和內(nèi)含子剪接沉默子等功能元件而發(fā)揮基因表達(dá)的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)rs1501299位點(diǎn)的T突變可能為EMs發(fā)生保護(hù)因素,之前并無該因子與EMs相關(guān)報(bào)道。Kaklamani等[5]研究證實(shí)，rs1501299 GT或GG基因型與脂聯(lián)素水平降低及乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。一項(xiàng)meta分析顯示，無論哪種癌癥類型,rs1501299T等位基因均與總體癌癥風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[7],考慮到EMs具有惡性疾病特質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)與之前癌癥方面的研究結(jié)論并不沖突。

rs17366568位于內(nèi)含子1,最近一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)其與歐洲人血漿脂聯(lián)素水平有較強(qiáng)關(guān)聯(lián),據(jù)推測(cè)位于rs17366568兩側(cè)的3個(gè)SNP均會(huì)影響轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)[8]。而本研究未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與EMs的易感性相關(guān),可能與rs17366568位點(diǎn)在本研究人群中A等位基因突變頻率明顯較低有關(guān)(本研究人群MAF=0.02,歐洲人口MAF=0.125),也說明了中國河南人群和歐洲白人的ADIPOQ存在遺傳異質(zhì)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，ADIPOQ的rs2241766、rs1501299位點(diǎn)變異與痛經(jīng)的發(fā)生相關(guān)。繼發(fā)性痛經(jīng)是EMs的典型表現(xiàn)，既往報(bào)道表明痛經(jīng)是由于子宮內(nèi)膜細(xì)胞異位著床引起的局部炎癥反應(yīng)引起的。這種反應(yīng)導(dǎo)致炎癥因子的釋放，促進(jìn)子宮收縮，隨后引發(fā)痛經(jīng)。Xuan等[9]發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素可通過調(diào)節(jié)JmjC家族組蛋白去甲基化酶3(JMJD3)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化和阻止巨噬細(xì)胞浸潤而進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，減少人巨噬細(xì)胞中的促炎細(xì)胞因子,如IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α，而在子宮內(nèi)膜發(fā)揮抗炎作用。研究報(bào)道，IL-1β與痛經(jīng)的疼痛作用有關(guān)，IL-8與痛經(jīng)的嚴(yán)重程度和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖有關(guān)[10]。所以，遺傳突變、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、各種炎癥因子在EMs及其相關(guān)痛經(jīng)的發(fā)生中可能具有相互協(xié)調(diào)的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn),ADIPOQ的rs1501299位點(diǎn)突變與EMs相關(guān)不孕的發(fā)生相關(guān)。EMs可引起盆腔粘連和輸卵管阻塞，從而導(dǎo)致不孕。卵母細(xì)胞受損也被認(rèn)為是EMs相關(guān)不孕的可能機(jī)制。研究表明，脂聯(lián)素可通過經(jīng)典的MAPK途徑對(duì)人、小鼠、山羊和豬的卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂和初始胚胎發(fā)育成熟發(fā)揮積極作用[11-12]，并且脂聯(lián)素可通過抑炎作用維持子宮內(nèi)膜的穩(wěn)定[13]。Kim等也發(fā)現(xiàn)ADIPOQ可能以自分泌/旁分泌/內(nèi)分泌方式在影響植入前胚胎發(fā)育和子宮容受性中起重要作用[14]，可見脂聯(lián)素與婦女不孕的發(fā)生密切相關(guān)，而ADIPOQ的基因位點(diǎn)突變與EMs相關(guān)不孕的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

ADIPOQ的SNP位點(diǎn)可能成為EMs發(fā)生發(fā)展的預(yù)測(cè)指標(biāo)，并且可評(píng)估并監(jiān)測(cè)EMs不孕患者的生育能力或作為其選擇體外受精(in vitro fertilization，IVF)的參考指標(biāo)，也有可能成為EMs痛經(jīng)和不孕治療的潛在靶點(diǎn)。本研究的局限是未檢測(cè)ADIPOQ基因多態(tài)性是否改變了蛋白表達(dá)水平,將來需明確脂聯(lián)素位點(diǎn)突變、脂聯(lián)素水平和EMs發(fā)生的具體關(guān)系,根據(jù)結(jié)論建議相關(guān)女性進(jìn)行生活方式干預(yù)(飲食和體育鍛煉)或適當(dāng)服用藥物(噻唑烷二酮/二甲雙胍/非諾貝特)以調(diào)節(jié)脂聯(lián)素水平,做到一級(jí)預(yù)防。此外,研究的樣本量相對(duì)較小及不能排除基因-基因和(或)基因-環(huán)境相互作用的影響也是本研究的局限之處。

綜上所述,ADIPOQ基因多態(tài)性可能與EMs發(fā)生、臨床分期、CA125水平、痛經(jīng)及不孕相關(guān),對(duì)EMs診斷及預(yù)防具有一定指導(dǎo)作用,后續(xù)需進(jìn)行大樣本、多中心、多基因及聯(lián)系環(huán)境因素進(jìn)行研究,進(jìn)一步解釋EMs的發(fā)病機(jī)制。