程曜峰，張麗娟，張 煒，葛鹍鵬*，鞠加學*

(1.華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術研究中心，石家莊 050015； 2.華北制藥集團華勝有限責任公司，石家莊 050015)

多粘菌素B是一種多肽類多組分抗生素，對絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌有較好的抗菌活性，如銅綠假單胞桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌及沙門氏菌屬等[1]。多粘菌素B內(nèi)部結構中的脂肪鏈是由10個氨基酸組成的7個多肽相互形成的，其相對分子質(zhì)量為1 301.56，分子式為C56H96N16O13·2H2SO4[2]。多粘菌素B中B1和B2是其主要成分，還含有 B3、B1-I等結構相近的成分。通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)多粘菌素B，提取純化方法有溶媒萃取法、吸附法、離子交換法、沉淀法和泡沫分離法等[3]。目前，生產(chǎn)上大多采用溶媒萃取法提純多粘菌素B，采用正丁醇在堿性條件下將多粘菌素B轉(zhuǎn)入有機溶劑相中[4]。傳統(tǒng)萃取工藝是在攪拌釜進行的，其工藝過程為：在攪拌釜內(nèi)加入一定量的正丁醇，再加入多粘菌素B粗提液進行萃取，攪拌2 h后停攪拌進行分相；水相按照相應比例加入正丁醇再重復萃取3次；多次萃取得到的正丁醇相合并后進入下工序；傳統(tǒng)的機械攪拌釜萃取工藝的總萃取率在75%～78%。傳統(tǒng)萃取工藝溶劑消耗較高，未萃取出來的部分多粘菌素B作為COD(化學需氧量)排放，加重了環(huán)保處理負擔。

微化工技術起始于上世紀末微控流技術[5]，相比于傳統(tǒng)的反應器其優(yōu)勢明顯，因此，微化工技術的出現(xiàn)引起了學術界和產(chǎn)業(yè)界等相關領域極大的關注。國內(nèi)微化工技術起步較晚，國內(nèi)各專業(yè)相關人士近十多年時間才開始研究并應用，目前，在高校和科研機構開展研究較多。在化工過程、化學合成、制藥工業(yè)、生物化學過程和分析等領域，微化工技術是發(fā)展最快和具有創(chuàng)造性的技術之一[6]。微化工技術主要是通過微反應器、微萃取器、微混合器、微換熱器及微化學分析裝置等微型化裝置來實現(xiàn)的，微反應器內(nèi)部微通道的特征尺寸一般在數(shù)十到幾百微米之間[7]。微反應器的比表面積可以達到10 000～50 000 m2/m3，而傳統(tǒng)的攪拌反應器設備的比表面積最多到1 000 m2/m3[8]。研究結果表明，應用微反應器可以有效強化傳遞或混合控制的化工過程，具有混合快、比表面積大、綠色安全、體積小、過程可連續(xù)和無放大效應等特點，可用于綠色化工藝開發(fā)[9]。微反應器在萃取方面也有較廣泛的用途，李韡等采用煤油-水-苯甲酸為模型體研究了微通道內(nèi)液-液兩相流傳質(zhì)特性[10]；荀濤等使用雙T型微通道，以磷酸三丁酯(TBP) 的環(huán)己烷溶液-乙酸水溶液為萃取體系，研究了不同條件對流型及傳質(zhì)的影響[11]；陳婭君等以硫酸銅溶液為水相，以DZ988N萃取劑為有機相，開展了相關的微通道液液萃取實驗研究和數(shù)值模擬[12]。多粘菌素B相對分子質(zhì)量較大，分子結構較復雜，粗提液中含有色素和雜蛋白等雜質(zhì)，在萃取時不易從相界面穿過，因此需要較大的傳質(zhì)系數(shù)。與傳統(tǒng)攪拌釜萃取相比，微反應器的尺寸屬于微尺度范疇，所產(chǎn)生的直接優(yōu)勢就是擴散時間短，混合過程快，微反應器內(nèi)傳質(zhì)推動力會隨之增加，從而擴大了單位面積和單位體積的擴散通量，這對于萃取過程非常有利。作者利用微化工技術設計了一種連續(xù)萃取工藝，采用微萃取器對多粘菌素B進行萃取工藝改進，提高萃取率和效率，同時減少溶劑消耗。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

多粘菌素B粗提液，華北制藥集團華勝有限責任公司；正丁醇，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)化學純。

高效液相色譜儀(SPD-M20A型紫外檢測器，LC-20AT泵，SIL-20A自動進樣器，CTO-10AS柱溫箱，日本Shimadzu公司)。平流泵(2PB-8008Ⅳ)，北京星達科技發(fā)展有限公司。pH計，F(xiàn)iveEasy，Mettler Toledo。

1.2 微萃取器

實驗用微萃取器由0.5～1.0 mm深的流動相微通道和微米級微孔分散膜模塊組成，每個微萃取器設有流動相進口、分散相進口、萃取混合液微通道出口，內(nèi)部結構如圖1所示。流動相與分散相形成錯流模式在微通道里混合。

圖1 微萃取器結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the microextractor structure

1.3 實驗流程

本實驗流程如圖2所示。多粘菌素B粗提液由平流泵3輸送至微萃取器1流動相入口，正丁醇由平流泵5經(jīng)過流量計輸送至微萃取器1分散相入口，被微孔膜分散成微小液滴進入流動相通道與多粘菌素B粗提液進行錯流混合，萃取?；旌陷腿『笪锪蠌某隹诔鰜砗笸ㄟ^連接管從分相器中部位置進入，進行分相。通過調(diào)整微萃取器與分相器之間連接管的長度可以進行不同萃取停留時間的考察實驗。后面串聯(lián)的幾級萃取器進、出料方式與第1級相同。通過對分散相溶劑流量的控制調(diào)整各級微萃取器的萃取比R(即正丁醇與粗提液的體積比)。各分相器分相后的溶劑相作為萃取液與后面的合并收集，廢液在最后1級分相后排出。本裝置可進行單級萃取或多級錯流萃取。實驗裝置操作簡單，快捷，穩(wěn)定性好。每組實驗進行完后，收集物料并計量水相(廢水)和溶劑相(萃取液)物料體積，取樣進行高效液相色譜檢測，計算萃取率等相關數(shù)據(jù)。

圖2 多級微萃取器流程示意圖Fig.2 Schematic diagram of the multi-stage microextractor process

1.4 萃取率

實驗中萃取性能用萃取效率E如式(1)表示:

(1)

式(1)中，Cn-B為正丁醇萃取液中多粘菌素B濃度，CW為廢水中多粘菌素B濃度，Vn-B為丁醇萃取液體積，VW為廢水體積。Cn-B和CW均為實驗后取相應樣品進行高效液相檢測得到的結果。Vn-B和VW為實驗結束后用量筒計量相應物料得到的體積。在多級萃取實驗中，各級出口收集的物料合并混合均勻后進行計量體積和取樣。

2 結果與討論

2.1 釜式萃取工藝萃取時間對萃取率的影響

實驗采取單級釜式萃?。涸诔叵乱哉〈紴檩腿瑢⒄〈寂c多粘菌素B粗提液按照萃取比R=1進行攪拌混合，機械攪拌一定時間后，將正丁醇-粗提液混合液置于分液漏斗中靜置1 h后，待出現(xiàn)清晰相界面后進行分液。上層為萃取液，下層為廢水，計量并取樣分析萃取液和廢水濃度。以不同的攪拌混合時間重復以上過程。釜式單級萃取時不同攪拌混合時間的萃取率見圖3。

圖3 攪拌混合時間對萃取率的影響Fig.3 Effect of mixing time on extraction rate

由圖3可見，隨著攪拌混合時間的增加，多粘菌素B在正丁醇中的萃取率隨之緩慢增大，說明多粘菌素B從水相通過相界面轉(zhuǎn)移到正丁醇相速度較慢，萃取過程受到傳質(zhì)速率影響比較大，對于釜式萃取工藝，需要延長兩相接觸時間來獲得高萃取率。

2.2 微萃取器分散孔徑的確定

溶劑相與水相的接觸面積是決定傳質(zhì)速率的關鍵因素之一。用微萃取器中的微孔結構將正丁醇分割成為微米級的液滴進入流動相微通道，分散到多粘菌素B粗提液的流動相中進行混合、傳質(zhì)。兩相的接觸效果與正丁醇的液滴大小有直接關系。試驗選擇工業(yè)上常用的1、5、10、20、50和100 μm幾種微孔介質(zhì)作為分散結構進行單級微萃取實驗，篩選適合的微萃取器分散孔徑。流動相通道采用深0.5 mm、寬1.0 mm的微通道。取多粘菌素B粗提液按照工藝要求的范圍調(diào)節(jié)好pH值，取萃取比R=0.5進行實驗，兩相分別經(jīng)過水相計量泵、溶劑相計量泵進入單級微萃取器，流出后進行分相，觀察并記錄乳化層厚度和分相時間，根據(jù)兩相體積和多粘菌素B的濃度計算萃取率。在上述相同條件下，分散相采用不同微孔尺寸進行萃取實驗，結果表明，10、20和50 μm微孔對應的萃取率和乳化情況較接近，如表1所示。

表1 不同微孔尺寸下的萃取率和乳化情況Table 1 Extraction rate and emulsification at different micropore sizes

數(shù)據(jù)顯示，1和5 μm微孔對應的萃取后溶液出現(xiàn)了不同程度的乳化現(xiàn)象，而且長時間靜置分相仍不徹底，導致萃取率偏低；微孔100 μm對應的萃取率偏低，說明隨著分散液滴的尺寸增大，傳質(zhì)效果受到影響。綜合萃取率、分相時間以及易工業(yè)化放大等因素，選擇50 μm微孔作為微萃取器的分散相內(nèi)構件進行后續(xù)實驗。

2.3 停留時間對微萃取器萃取率的影響

從2.1實驗可知，兩相接觸時間對萃取率有較明顯的影響，對于釜式萃取工藝和微萃取器萃取工藝，兩相接觸時間均是萃取率的主要影響因素之一。實驗取內(nèi)徑1.5 mm管作為微萃取器與分相器的連接管，在流動相流量50 mL·min-1，萃取比R=0.5的條件下，通過調(diào)整連接管長進行停留時間的影響實驗。圖4所示為萃取率與停留時間的關系圖。

圖4 停留時間對萃取率的影響Fig.4 Effect of residence time on extraction rate

由圖4可知，當停留時間達到12 s以上時，萃取率增長緩慢，也就是說該萃取體系在12 s已達到平衡。與釜式萃取設備達到萃取平衡所需的時間相比，微萃取器效率顯著。

2.4 分散相線速度對萃取率的影響

從圖1微萃取器內(nèi)部結構可知，分散相從微孔沿垂直于流動相流動方向錯流進入微通道與流動相混合。周月等研究表明，在微孔分散反應器中，流動相流體相同表觀速度下，隨著分散相流體表觀速度的增加，截面上的傳質(zhì)界面面積逐漸提高，傳質(zhì)系數(shù)也相應提高[13]。對于本實驗的微萃取體系，以多粘菌素B粗提液作為流動相以2.0 m·s-1的線速度進入微萃取器，在萃取比R=0.6、停留時間12 s的條件下，通過改變微孔膜面積，使正丁醇作為分散相以不同的線速度穿過微孔膜進行實驗。圖5所示為萃取率和分散相壓差(分散相入口與分相器之間的壓力差)與分散相穿過微孔膜線速度的關系。

圖5 萃取率和分散相壓差隨分散相線速度的變化Fig.5 Effect of extraction rate and dispersion phase pressure on dispersion phase velocity

由圖5可知，隨著分散相線速度提高，萃取率增長迅速，線速度達到3.0 m·s-1后萃取率E增長趨緩。分散相壓差與線速度成正比例增長，微孔膜面積的減小使分散相穿過膜的阻力加大。為了獲取較高的萃取率和較小的分散相壓差，分散相線速度選擇3.0～3.5 m·s-1較為適合。

2.5 流動相線速度對萃取率的影響

液液兩相在微通道內(nèi)一般有彈狀流、滴狀流、并行流、環(huán)形流等幾種流型[14]，不同的流型傳質(zhì)效果不同，流型主要取決于兩相流量比和流速。劉妍等研究表明，在相同停留時間下，微通道內(nèi)流速增大，萃取率隨之增大[15]。本實驗在3.0 m·s-1的分散相穿膜線速度、萃取比R=0.6及停留時間12 s的條件下，通過改變微萃取器通道尺寸和流動相流量調(diào)整不同的流動相流速進行萃取實驗。實驗結果表明，流體在通道中的線速度對萃取率E有明顯影響，如圖6所示。

圖6 通道內(nèi)流動相線速度與萃取率的變化曲線Fig.6 Variation curve of linear velocity of the mobile phase in the channel versus extraction rate

從圖6可以看出，流動相在微萃取器通道內(nèi)線速度在2.0 m·s-1以下時，萃取率變化較大；達到2.0 m·s-1以上時，有明顯的拐點，隨著線速度進一步增大，萃取率提高幅度趨緩。因此，采用流動相線速度2.5～4.0 m·s-1的范圍能得到較高的萃取率，動力消耗也較為合理。

2.6 多級錯流萃取兩相比例的確定

多級錯流微萃取工藝每級都是加入新溶劑，使水相中的溶質(zhì)萃取較徹底。李碩等研究表明，多級錯流萃取中溶質(zhì)萃取率隨著萃取級數(shù)的增大而增大；當萃取級數(shù)相同時，萃取比越大，萃取率越高[16]。但萃取比越大，消耗溶劑量越大。本實驗取多粘菌素B粗提液1.0 L，正丁醇分別按照不同萃取比R加入，在3 m·s-1的分散相穿膜線速度、3.3 m·s-1的流動相線流速和停留時間12 s以上的條件下進行萃取實驗。實驗結果顯示，多級微萃取器錯流萃取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)攪拌釜，如表2所示。

表2 多級串聯(lián)微萃取與攪拌法萃取率、溶劑消耗對比Table 2 Comparison of extraction rate and solvent consumption between multi-stage microextraction and stirring method

由表2數(shù)據(jù)可以看出，傳統(tǒng)攪拌法在多次萃取、溶劑加量多的情況下，萃取率E仍然處于較低水平；每次萃取結束都要單獨進行靜置分相才能進行下一次，操作時間長。多級串聯(lián)微萃取器萃取率和效率優(yōu)勢明顯，溶劑使用量也較釜式萃取工藝明顯減少。綜合以上數(shù)據(jù)，三級微萃取器串聯(lián)，正丁醇分次加入的萃取比R為0.6、0.2和0.1時總萃取率和效率俱佳。

3 結論

利用微型化技術替代傳統(tǒng)攪拌釜方法進行多粘菌素B萃取，通過對多級串聯(lián)微萃取器萃取方法中關鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化，取得了較好的實驗結果。1)微萃取器的分散膜微孔大小對傳質(zhì)效果和乳化現(xiàn)象有直接影響。2)微萃取工藝在短停留時間內(nèi)可以達到萃取平衡，效率明顯優(yōu)于釜式萃取工藝。3)分散相和流動相流速對兩相之間傳質(zhì)影響較大，在一定范圍內(nèi)，流速越大，傳質(zhì)效果越好。4)微萃取器串聯(lián)級數(shù)和每級溶劑加量比例對萃取率有一定影響，選用三級串聯(lián)的微萃取器系統(tǒng)較適合該體系。多級錯流微萃取工藝在萃取率、生產(chǎn)效率、溶劑使用量比釜式攪拌萃取工藝具有明顯優(yōu)勢，并且用時短，重復性、穩(wěn)定性、耐用性良好，且操作簡單，可實現(xiàn)連續(xù)運行，適用于多粘菌素B等多肽類抗生素的溶劑萃取，解決了傳統(tǒng)攪拌釜萃取工藝萃取率低、用時長、溶劑消耗多、COD排放較多等問題，為實現(xiàn)多肽類抗生素原料藥萃取綠色生產(chǎn)開拓了新思路。