劉雅靜,劉勤勤

(陜西省西安市長慶油田職工醫(yī)院 檢驗科,陜西 西安,710201)

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)致病力較強，可形成多種抗原蛋白、酶及毒素等，是導致患者出現(xiàn)感染性疾病的主要病原菌。耐甲氧西林金葡菌(MRSA)對于全部β內酰胺類抗生素均有耐藥性，同時對氟喹諾酮類、氨基糖苷類及大環(huán)內酯類抗菌藥物也都有耐藥性[1-2]。mecA基因介導了甲氧西林的耐藥性，其基因編碼為青霉素聯(lián)合蛋白(PBP)2a。只要金葡菌內可檢測到編碼PBP2a或mecA基因，即可認定是MRSA菌株。研究[3]顯示,mecA基因陰性、苯唑西林耐藥MRSA內檢測出mecC基因可能是甲氧西林耐藥所介導的另一機制。LI M等[4]2012年研究發(fā)現(xiàn)金葡菌內有細胞壁錨定蛋白受控sasX的編碼基因，多存在于醫(yī)院中的致病性金葡菌內。本研究分析了金葡菌對臨床常用抗菌藥物的敏感性及其毒力基因檢測結果，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 菌株

采集2013年8月—2018年8月在本院分離的金葡菌129株行藥敏試驗，排除患者同一位置的重復菌株，金葡菌分離自胸腹水、腦脊液及血液等無菌體液標本中。將金葡菌ATCC 29213作為標準菌株。

1.2 抗菌藥物和試劑

試劑與器皿: 聚合酶鏈反應(PCR)試劑(購自日本TaKaRa公司)、Mueller-Hinton瓊脂和哥倫比亞血平皿(購自英國OXOID公司)?？咕幬? 利奈唑胺(購自英國Sequoia Research Products公司)、磷霉素、萬古霉素、甲氧芐啶、替考拉寧、去甲萬古霉素、左氧氟沙星、青霉素、利福平、苯唑西林、慶大霉素、氨芐西林、阿米卡星、頭孢唑林(購自中國食品藥品檢定研究院)。

1.3 研究方法

① 檢測抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC): 依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)制訂的M07-A9方案中的推薦方法進行檢測，氨芐西林受試含量0.04～62.00 mg/L,甲氧芐啶受試含量是0.078～150.000 mg/L,磷霉素的受試含量是0.126～249.000 mg/L,其他藥物受試含量為0.07～130.00 mg/L,接種菌量為104cfu/點，同時設立無抗菌藥物的對照平皿。培養(yǎng)24 h后可觀察到細菌的生長，對結果進行讀取，受試藥物對于質控菌株MIC數(shù)值位于質控范圍內，對照平皿中受試菌良好生長。MIC定義為未看到細菌生長的最低藥物含量。② 結果判定: 依據(jù)2014年CLSI準則[5]對藥敏結果進行判定，苯唑西林MIC高于4.00 mg/L即判定為MRSA。③ 制備MRSA DNA模板，選取新鮮的MRSA菌落1～2個，放置在eppendorf管內，含TE(由Tris和EDTA配制而成)緩沖液200 μL; 搖勻后加入10 μL溶葡萄球菌素，水浴30 min,在干熱器內加熱后快速冷卻，離心獲取上清液是金葡菌的DNA模板。④ PCR擴增條件，預變性95 ℃下6 min,循環(huán)條件為95 ℃下35 s、49 ℃(mecA)/48 ℃(mecC)/51 ℃[殺白細胞毒素(PVL)]/49 ℃(sasX)下30 s,72 ℃下45 s,共進行4次循環(huán)，而后延伸,70 ℃下6 min,儲存。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用WHONET 5.6軟件進行藥敏數(shù)據(jù)分析。

2 結 果

2.1 苯唑西林耐藥菌株

苯唑西林瓊脂稀釋結果顯示,70株對苯唑西林耐藥(苯唑西林的MIC>4.00 mg/L),判定為MRSA,占54.26%。其余59株為甲氧西林敏感金葡菌(MSSA),占45.74%。

2.2 PCR檢測mecC與mecA基因

臨床分離進行MRSA的DNA模板制備，對臨床分離所得的45株MRSA分別采用mecA、mecC基因的PCR引物進行PCR擴增，檢測發(fā)現(xiàn)耐藥基因mecA陽性檢出率為100.00%，耐藥基因mecC則未檢出，見圖1。

圖1 臨床MRSA菌株的mecA基因擴增圖

2.3 PCR檢測MRSA內sasX基因與PVL

PCR檢測MRSA內sasX基因與PVL基因發(fā)現(xiàn),sasX基因陽性檢出率為46.67%(21/45),sasX基因陰性檢出率為53.33%(24/45),瓊脂糖電泳結果提示45株MRSA內均未檢出PVL基因，見圖2。

圖2 MRSA菌株內sasX基因擴增圖

2.4 抗菌藥物對MSSA、MRSA的MIC情況分析

MRSA對多種抗菌藥物的耐藥率高于MSSA,MRSA對于β內酰胺類藥物耐藥率高于MSSA,且對左氧氟沙星、阿米卡星及慶大霉素等非β內酰胺類藥物也有耐藥性，其耐藥率為48.00%以上，但75.00%以上MRSA對甲氧芐啶與利福平比較敏感。MSSA對β內酰胺類藥物比較敏感，除青霉素外，頭孢唑林、氨芐西林及苯唑西林對MSSA的90%最低抑菌濃度(MIC90)、50%最低抑菌濃度(MIC50)都低于1.00 mg/L,且MSSA對非β內酰胺藥物也非常敏感，其耐藥率均低于11.00%。見表1、2。

2.5 抗菌藥物對sasX陰性與sasX陽性的MRSA的MIC分析

sasX陰性與sasX陽性的MRSA對左氧氟沙星、磷霉素和β內酰胺類藥物都比較耐藥，但對甲氧芐啶、利福平、阿米卡星及慶大霉素的耐藥率則不完全一致，見表3、4。

3 討 論

金葡菌會導致肺炎、骨感染及皮膚軟組織感染等感染性疾病，同時也是造成醫(yī)療機構內血流感染的主要病原菌，臨床應用甲氧西林后即發(fā)生了首株MRSA[6]。隨后幾十年中，MRSA在全世界范圍內開始流行，且臨床患者產(chǎn)生的耐藥問題也越來越嚴重，引起了廣泛關注。CHINET細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)2014年數(shù)據(jù)報道[7]顯示，臨床金葡菌檢出率是9.6%,位居全年臨床分離菌株的第5位，且位居革蘭陽性菌的首位。

表1 抗菌藥物對MRSA的MIC分析

表2 抗菌藥物對MSSA的MIC分析

表3 抗菌藥物對sasX陰性MRSA的MIC分析

表4 抗菌藥物對sasX陽性MRSA的MIC分析

本研究分離的MRSA檢測結果顯示,MRSA對非β內酰胺類與β內酰胺類抗菌藥物都比較耐藥，但對于磷霉素與甲氧芐啶比較敏感。除青霉素外,MSSA對于其他β內酰胺類抗菌藥物依然敏感，其MIC90均低于1.00 mg/L。本研究顯示菌株均未對利奈唑胺、提卡拉寧及萬古霉素耐藥，和CHINET細菌耐藥性檢測數(shù)據(jù)[8]近似。金葡菌能夠形成特殊PBP2a,為mecA基因編碼，經(jīng)過轉座子所攜帶同時整合到葡萄球菌染色體mec位置[9-11]。因此，只要金葡菌內可檢測出mecA基因，就是MRSA菌株，本研究顯示MRSA中有45株攜帶mecA基因。

相關研究[12]顯示,MRSA菌株中對于頭孢西丁與苯唑西林都耐藥者其PBP2a、mecA基因都是陰性。同時PCR檢測顯示,MRSA內檢測出和mecA基因同源性為70%以上耐藥基因，被稱作mecALGA251基因。此團隊將庫存的金葡菌行mecALGA251基因篩選，結果顯示在1975年所分離的1株金葡菌內也有相同基因型，說明金葡菌內存在mecALGA251基因已有40余年時間，且可能來自人類菌株。2012年，臨床將mecALGA251基因重新命名為mecC基因。本研究顯示，檢測45株MRSA沒有mecC基因。目前關于mecC基因為陽性MRSA也只在歐洲有相關報道，該基因可能有地域差異，另外也可能為PCR擴增條件或引物不夠完善，還需對檢測方法進一步改善。若微生物實驗室內檢測出MRSA對于頭孢西丁或苯唑西林耐藥，且PCR檢測mecA基因是陰性，則可能存在mecC基因[13-14]。2012年臨床首次檢測到金葡菌內存在sasX基因，該基因多存在于醫(yī)院環(huán)境金葡菌內，臨床分離金葡菌可能會經(jīng)過獲取sasX基因對醫(yī)院環(huán)境更加適應，導致醫(yī)院內連續(xù)感染。本研究結果顯示,45株MRSA內sasX基因陽性率為46.7%,同時對于非β內酰胺類抗菌藥物的耐藥率比sasX基因陰性MRSA高，和白耀霞等[15]研究結論一致。目前，臨床MRSA問題仍比較嚴重，美國CDC報道[16]顯示，異質性萬古霉素中介金葡菌、萬古霉素中介金葡菌與萬古霉素耐藥金葡菌在世界范圍內均有報道，而萬古霉素耐藥菌株是革蘭陽性菌內耐藥廣泛的菌株，臨床上可有效治療該菌株的藥物還不太多。

綜上所述，MRSA對臨床大多數(shù)抗菌藥物都有耐藥性，臨床需對MRSA加強監(jiān)測。