李金玲， 楊愿愿， 劉思思， 趙建亮， 應(yīng)光國， 陳長二

(教育部環(huán)境理論化學(xué)重點實驗室∥廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點實驗室∥華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 環(huán)境研究院， 廣州 510006)

中國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)和使用國[1]. 據(jù)估計，我國抗生素年使用量超過1.6×105t[2]，然而藥用抗生素只有少部分可以被機(jī)體吸收利用[3]，大部分會以藥物原形或代謝產(chǎn)物的形式進(jìn)入環(huán)境[4-5]. 抗生素一旦進(jìn)入環(huán)境，可能通過食物鏈進(jìn)行傳遞[6]，進(jìn)而對人類和動物健康以及生態(tài)環(huán)境造成極大的威脅[7-8]. 另一方面，在低濃度長期暴露下，抗生素還會誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性基因[9]. 因此，了解抗生素在環(huán)境中的賦存水平，可以為相關(guān)環(huán)境部門評估抗生素生態(tài)風(fēng)險與管理抗生素的使用提供強有力的數(shù)據(jù)支撐.

氟喹諾酮類抗生素(FQs)是在喹諾酮類抗生素主環(huán)的6位或8位加上1個F原子衍生而來[10]，因其具有廣譜性、抗菌性強等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致其在環(huán)境中有較高的檢出率和檢出濃度[11]. 目前，環(huán)境樣品中FQs的定量方法主要有高效液相色譜法[12-14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]、酶聯(lián)免疫分析法[18-19]等. 但是在復(fù)雜的基質(zhì)干擾下，對目標(biāo)污染物的準(zhǔn)確檢測要求儀器有較高的選擇性和靈敏度，電噴霧離子源高分辨飛行時間質(zhì)譜可提供目標(biāo)物母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，不僅提高了目標(biāo)物定性篩查的可靠性，也可獲得較高靈敏度的定量數(shù)據(jù).

本文利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF)在電噴霧正離子條件的3種模式：MS(Mass Scan)、MSE、MRM(Multiple Reaction Monitoring)，建立同時測定5種FQs的定量分析方法，并與超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-TQMS)的方法進(jìn)行比較研究.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)時間飛行質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF，美國Waters)，配有電噴霧離子源；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-TQMS，美國Waters)，配有電噴霧離子源；PURELAB flex純水儀(英國ELGA)；玻璃纖維濾膜(GF/F，0.7 μm, 英國Whatman)；Oasis 親水親油平衡(Hydrophilic Lipophilic Balance,HLB)固相萃取柱(500 mg，6 mL，美國Waters);甲醇、乙腈(HPLC級，德國Merck)；HPLC級甲酸(HPLC級，阿拉丁)；本實驗用水均為超純水(18.2 MΩ·cm).

標(biāo)準(zhǔn)品：環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CFX)、恩諾沙星(Enrofloxacin，EFX)、諾氟沙星(Norfloxacin，NFX)、氧氟沙星(Ofloxacin，OFX)、培氟沙星(Pefloxacin，PFX)和內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星-D8(Ciprofloxacin-D8，CFX-D8)均購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH. 所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均不低于98%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)).

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品，并用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放入-20 ℃低溫的冰箱中避光保存.

1.2 質(zhì)譜方法的建立

1.2.1 UPLC-QTOF方法 將質(zhì)量濃度為100 μg/L的各化合物單標(biāo)分別在UPLC-QTOF上進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，分析得到母離子，并在高能量通道掃描其二級質(zhì)譜. 隨后，在MRM模式下優(yōu)化5種FQs的特征離子對、毛細(xì)管電壓、碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)，選取響應(yīng)強、干擾小的離子作為定量和定性離子.

1.2.2 UPLC-TQMS方法 將各FQs的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品在全掃描模式下直接進(jìn)樣，并利用MassLynx4.1軟件中質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化的功能，確定各目標(biāo)化合物的最優(yōu)碰撞能、錐孔電壓等參數(shù).

1.3 色譜方法的建立

色譜柱選用Waters ACUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm). 在低pH條件下可保持FQs在流動相中穩(wěn)定的溶解狀態(tài)，采用甲酸來控制流動相的pH，比較甲醇和乙腈作有機(jī)相時，目標(biāo)物色譜峰的峰形、響應(yīng)強度以及分離度. 此外，本文考察了0.1%(體積分?jǐn)?shù)，全文同)甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時對目標(biāo)物峰形和響應(yīng)值的影響. 隨后，調(diào)節(jié)流動相初始體積比和洗脫梯度，確定最佳液相測試方法.

柱溫不僅會影響目標(biāo)化合物的保留時間，也會影響目標(biāo)物的分離和響應(yīng). 比較不同柱溫(30、40、50 ℃)對目標(biāo)化合物響應(yīng)強度的影響.

在UPLC-TQMS上直接應(yīng)用UPLC-QTOF確定的色譜柱、流動相及液相洗脫方法，并適當(dāng)優(yōu)化洗脫梯度，以使目標(biāo)化合物的響應(yīng)和峰形更好.

1.4 方法性能的比較

1.4.1 線性關(guān)系 將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、20、50、100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件測定，使用內(nèi)標(biāo)法定量. 以目標(biāo)物定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積之比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.2 定量限、檢出限及數(shù)據(jù)存儲大小比較 為測定儀器檢出限和定量限，將低濃度的混標(biāo)工作液(7個平行樣)在2臺儀器的各個模式下分別連續(xù)測定，同時準(zhǔn)備7組甲醇溶液，按以上步驟測定. 通過幾次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，計算儀器檢出限和定量限[20]. 此外，比較UPLC-QTOF的3種質(zhì)譜采集模式下和UPLC-TQMS的MRM模式下，測定1個樣品所需的數(shù)據(jù)存儲空間.

1.4.3 儀器的精密度 對低、中、高質(zhì)量濃度的FQs混標(biāo)工作液重復(fù)測定6次，根據(jù)6次重復(fù)測定數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來考察儀器的精密度.

1.5 方法應(yīng)用

于廣東省茅洲河上游和中游分別采集3個1 L水樣，加入0.4 mL 4 mol/L硫酸以調(diào)節(jié)pH，加入50 mL甲醇抑制微生物的生長. 上游和中游樣品分別命名為樣品1、2. 將水樣置于含有冰袋的采樣箱，迅速運回實驗室. 參照文獻(xiàn)[21]的方法，將1 L水樣過玻璃纖維濾膜，加入100 μL 1 mg/L CFX-D8內(nèi)標(biāo)，混勻后采用固相萃取法提取水樣中抗生素. 依次用10 mL甲醇和10 mL超純水活化HLB萃取柱，將過濾后的水樣以5～10 mL/min的流速加載于固相萃取柱，樣品瓶用50 mL 5%甲醇水潤洗2次. 用10 mL 超純水清洗小柱，對萃取柱真空抽干2 h，用10 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干，用1 mL初始流動相復(fù)溶，采用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，將濾液分別在2臺儀器各模式下進(jìn)行檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 UPLC-QTOF質(zhì)譜條件 優(yōu)化的質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓為2.0 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h；掃描模式MS/MSE/MRM，質(zhì)荷比m/z范圍為50～1 200；Lockmass為亮氨酸腦啡肽(2 μg/L)溶液；采集時間0.5 s，采集間隔時間10 s，掃描精確質(zhì)荷比為556.277. 5種FQs在該儀器上的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1. UPLC-QTOF所采集目標(biāo)物的相對分子質(zhì)量偏差均小于±0.3 mDa，表明該儀器可提供較精確的質(zhì)荷比，可為復(fù)雜環(huán)境基質(zhì)樣品的準(zhǔn)確定量分析提供條件.

表1 不同F(xiàn)Qs在UPLC-QTOF上的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 The parameters of different FQs detection under UPLC-QTOF

2.1.2 UPLC-TQMS的質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源、正離子模式；毛細(xì)管電壓為2.0 kV，錐孔電壓為40 V；離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣溫度為300 ℃；脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流流速為150 L/h；掃描模式為MRM. FQs結(jié)構(gòu)中含有羧基和氨基，當(dāng)溶液為酸性時，其呈現(xiàn)陽離子狀態(tài)，并在ESI+模式下，易形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，可作為母離子. 5種FQs及其內(nèi)標(biāo)在該儀器上的質(zhì)譜采集參數(shù)見表2.

2.2 液相條件的優(yōu)化

2種儀器優(yōu)化后的液相條件：柱溫為40 ℃，樣品室溫度為10 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL. 流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為甲醇. 梯度洗脫程序設(shè)置為：(1)UPLC-QTOF：0～2.5 min，20% B；2.5～2.6 min，20%～100% B；2.6～3.6 min，100% B；3.6～3.7 min，100%～20% B；3.7～4.5 min，20% B. 流速為0.5 mL/min. (2)UPLC-TQMS：0～2.5 min，10% B；2.5～2.6 min，10%～100% B；2.6～3.6 min，100% B；3.6～3.7 min，100%～10% B；3.7～4.5 min，10% B. 流速為0.5 mL/min.

表2 不同F(xiàn)Qs在UPLC-TQMS上的質(zhì)譜采集參數(shù)

與乙腈相比，當(dāng)有機(jī)相為甲醇時，色譜峰的分離度更高，且由于甲醇在氫鍵作用下是較強的質(zhì)子供體，可提高目標(biāo)物的靈敏度. 不同的酸度會對目標(biāo)物離子化效果、峰形和響應(yīng)強度造成影響. 甲酸的加入不僅使其峰形更加對稱和尖銳，且利于FQs的離子化，得到較強的響應(yīng). 以環(huán)丙沙星為例，在不同流動相條件下的色譜峰見圖1A. 0.1%甲酸水溶液-甲醇流動相為本實驗最優(yōu)流動相，用于后續(xù)實驗. 目標(biāo)化合物的響應(yīng)強度隨柱溫的升高而增強(圖1B)，考慮到柱溫對色譜柱壽命的影響，故選取40 ℃作為最佳柱溫. 圖2為環(huán)丙沙星在UPLC-QTOF上的3種模式(MSE、Full scan、MRM)和UPLC-TQMS的MRM模式下定量離子的色譜圖.

圖1 不同流動相條件及柱溫對環(huán)丙沙星色譜峰的影響

圖2 環(huán)丙沙星在UPLC-TQMS和UPLC-QTOF模式下定量離子的色譜圖

2.3 線性關(guān)系

2臺儀器各個采集模式下，目標(biāo)物的線性范圍、線性方程見表3和表4，各模式下目標(biāo)物線性方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，表明其在相應(yīng)的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系. 崔敬鑫等[22]研究中FQs的線性范圍為5～100 μg/L，本文方法的線性范圍與其方法的線性范圍相當(dāng).

2.4 檢出限、定量限及數(shù)據(jù)量比較

在UPLC-TQMS上，目標(biāo)物的檢出限和定量限分別為0.08～0.10 μg/L和0.32～0.92 μg/L，在UPLC-QTOF上，檢出限和定量限為0.04～0.22 μg/L和0.17～0.90 μg/L，2臺儀器均顯示出較高的靈敏度. 對比其他文獻(xiàn)報道的方法[23]，本方法對目標(biāo)物的檢出限與定量限均低于或接近于其他方法的檢出限與定量限，且本方法的分析時間較短.

很明顯2臺儀器的MRM采集模式所需的數(shù)據(jù)存儲空間更小(表3、4)，且UPLC-QTOF上MRM模式更具節(jié)省存儲空間的優(yōu)勢. 對比之下，MS和MSE模式占據(jù)的存儲空間主要用于存儲更多的樣品質(zhì)譜信息.

2.5 儀器的精密度

對3種不同質(zhì)量濃度的FQs混標(biāo)工作液重復(fù)測定6次，以考察儀器的精密度，測定濃度的重復(fù)性結(jié)果如表5所示. 結(jié)果表明：用UPLC-TQMS測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～3.3%之間. 在UPLC-QTOF的MS/MSE/MRM模式下，測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.8%～3.8%、0.7%～11%和0.5%～6.7%，表明該檢測方法有良好的重現(xiàn)性. 可以看出2臺儀器的精密度良好.

表3 5種FQs在UPLC-TQMS的定量限、檢出限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和數(shù)據(jù)量Table 3 The limits of detection and quantification, linear range, correlation coefficient and data size for 5 FQs under UPLC-TQMS

表4 5種FQs在UPLC-QTOF不同采集模式下的定量限、檢出限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和數(shù)據(jù)量

表5 UPLC-QTOF和UPLC-TQMS下5種FQs質(zhì)量極度檢測結(jié)果的精密度Table 5 The precision of concentration detection for 5 FQs under UPLC-QTDF and UPLC-TQMS

2.6 環(huán)境樣品分析

將實際環(huán)境樣品于2臺儀器各模式下進(jìn)行檢測，均只有OFX被檢出，其他4種喹諾酮質(zhì)量濃度低于檢出限. 定量數(shù)據(jù)均由MassLynx4.1軟件中的TargetLynx計算得到(表6). 2臺儀器各模式下所測定的樣品1與樣品2的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一致的大小規(guī)律，且平行測試之間偏差較小. UPLC-QTOF的MSE和UPLC-TQMS上測定的質(zhì)量濃度無顯著性差異，但是UPLC-QTOF的MRM模式和MS模式下檢出的質(zhì)量濃度高于UPLC-TQMS，可能是不同儀器和不同模式下的基質(zhì)效應(yīng)存在顯著差異.

表6 UPLC-QTOF和UPLC-TQMS對氧氟沙星質(zhì)量濃度的測定

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜，建立了5種FQs的定量檢測方法，各目標(biāo)物在3種檢測模式(MS/ MSE/ MRM)下的方法檢出限在0.04～0.22 μg/L之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.5%～11%之間. 通過與超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法比較發(fā)現(xiàn)，超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜具有與超高效液相色譜-質(zhì)譜同樣出色的定量能力和儀器精密度. 而高分辨飛行時間質(zhì)譜還可對目標(biāo)物準(zhǔn)確定性，從而有效降低質(zhì)譜MRM模式下假陽性的情況. 因此，本文為氟喹諾酮類抗生素的快速、準(zhǔn)確定量分析提供了一種可靠的方法，具有較強的實用價值.