雞源大腸桿菌M1株的分離鑒定及遺傳進化分析

王育偉，劉亞東，周玉剛，張曉暉，周愛民，李廷見

（綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院畜禽水產(chǎn)研究所，四川 綿陽 621023）

大腸桿菌（E.coli）是養(yǎng)殖環(huán)境中存在最為廣泛的病原菌之一［1］，常單獨或混合感染引起家禽細菌性疾病，每年給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。E.coli單純感染可引起禽大腸桿菌病［2］，主要癥狀包括心包炎、失明、腹瀉、滑膜炎、大腸桿菌性肉芽腫和臍炎等。常與沙門氏菌（Salmonella）和雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）共同感染引起雞白痢、雞毒支原體病等疾?。?］。

細菌鑒定對精準的用藥和疾病防控具有重要意義，除了常規(guī)的形態(tài)學鑒定方法以外，分子生物學鑒定方法因分型精確等優(yōu)點而成為重要的鑒定方法。16S rDNA 序列是研究細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類最常用的管家遺傳標［4］，atpD 基因等功能基因也非常有助于細菌進化分析［5］。本研究對從綿陽一養(yǎng)雞場腹瀉病例中分離到的M1菌進行鑒定，并建立16S rDNA 和atpD 基因遺傳進化分析，為科學防控該類疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 從四川省綿陽市游仙區(qū)一養(yǎng)雞場腹瀉病例中分離出1 株細菌，命名為M1 菌。

1.2 主要試劑 糖鐵瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基，購自成都康迪生物科技有限公司；伊紅美藍培養(yǎng)基，購自青島日水生物技術(shù)有限公司；微量生化反應(yīng)管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒（TIAN amp Bacteria DNA Kit），購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 菌株的分離培養(yǎng) 將采樣拭子置于5 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，然后于普通固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色后鏡檢，觀察細菌形態(tài)。用接種針挑取形態(tài)、大小不同的單菌落在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h（37 ℃），挑取深紫色帶有金屬光澤的單菌落于麥康凱固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，然后進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4 生化試驗鑒定 將初步分離到的菌株純化擴菌后，取菌液分別接種于硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖、七葉苷培養(yǎng)基中，37 ℃溫箱培養(yǎng)6～48 h，觀察并記錄試驗結(jié)果。

1.5 細菌基因組DNA提取 取單菌落接種于5mL培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，取1.0 mL 菌液于1.5 mL離心管中，13 000 r/min 離心2 min，棄上清。沉淀重懸于1.0mL 0.85% NaCl中。室溫下13000r/min離心2 min，棄上清。沉淀重懸于550 μL 1×TE緩沖液中。加17 μL 溶菌酶（35 mg/mL），37 ℃溫育30 min。加3 μL 蛋白酶K（20 mg/mL），37 ℃溫育30 min。加30 μL 10% SDS，37 ℃溫育30 min。加100 μL 5 M NaCl 充分混勻。加80 μL CTAB/NaCl 溶液，混勻，65 ℃水浴10 min。加等體積（0.7～0.8 mL）氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕振蕩混勻。室溫下13000r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到一新的1.5 mL 離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），輕輕振蕩混勻。再將上清液轉(zhuǎn)移到一新的1.5 mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕振蕩混勻。棄上清，加500 μL 70%乙醇，輕輕顛倒數(shù)次（洗鹽）。4 ℃15 000 r/min離心7 min。重復洗鹽兩次。倒置離心管，干燥DNA沉淀7 min。DNA 沉淀溶于100 μL 1×TE緩沖液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 16S rDNA系統(tǒng)進化分析 設(shè)計16S rDNA引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，提取M1 菌株的16S rDNA，PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后測序，利用NCBI 中BLAST 程序?qū)⒎蛛x菌株的16S rDNA 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已知基因序列進行比對。利用生物信息學軟件DNAStar 和MEGA6 對分離菌株與部分大腸桿菌的核苷酸序列進行同源性比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。16S rDNA 的PCR 擴增反應(yīng)體系為100 mL：Taq（5 U/mL）0.8 mL，10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）10 mL，dNTP Mixture（2.5 mmol/each）8 mL，模 板DNA 2.5 ng，引物F1 和R1（10 mol/L）各2 mL，ddH2O 補足到100mL。反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃1min，57 ℃1 min，72 ℃60 s，30 個循環(huán)；72 ℃5 min。16S rDNA引物序列如表1所示。

表1 16S rDNA與atpD基因引物序列

1.7atpD 基因系統(tǒng)進化分析 設(shè)計atpD 基因引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，提取M1 菌株的atpD 基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后測序，利用BLAST 軟件對相似菌株的atpD 基因序列進行比對，利用MEGA6 軟件中的最大可能性法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。100 mLatpD 基因反應(yīng)體系為：Taq（5 U/mL）0.8 mL，10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）10 mL，dNTP Mixture（2.5 mmol/each）8 mL，模板DNA 2.5 ng，引物F1 和R1（10 mol/L）各2 mL，ddH2O 補足到100 mL。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃1 min，3 個循環(huán)；55 ℃135 s，72 ℃ 75 s，95 ℃ 35 s，30 個 循 環(huán)；55 ℃ 75 s，72 ℃5 min，72 ℃7 min。atpD 基因引物序列如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌培養(yǎng)與分離鑒定 M1 菌接種在LB 肉湯純化至鏡檢為單一細菌形態(tài)，在普通固體培養(yǎng)基上生長出圓形、光滑、邊緣整齊或不太整齊的乳白色中等偏大菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上呈桃紅色。革蘭氏染色后在油鏡下可以觀察到兩端鈍圓的粉紅色短桿菌，革蘭氏陰性，散在或成對出現(xiàn)。

2.2 生理生化試驗 生理生化試驗結(jié)果表明，M1菌可以發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；運動性試驗為陽性；吲哚（I）試驗、甲基紅（M）試驗為陽性；VP（V）試驗和枸櫞酸鹽（C）利用試驗為陰性；產(chǎn)硫化氫（H2S）試驗為陰性；尿素酶試驗為陰性；觸酶試驗為陽性。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》判定，M1菌符合大腸桿菌的生化特征。

表2 M1菌與其他菌株的序列同源性表（同源性＝1-差異率×100%）

2.3 16S rDNA 系統(tǒng)進化與同源性分析 將16S rDNA序列與GenBank中的相近序列進行比對，從16S rDNA 序列的同源性分析結(jié)果來看，M1 菌株與E.coli、痢疾志賀菌、馬爾莫拉大腸桿菌等菌的同源性均在99%以上。利用MEGA6.0構(gòu)建了M1與參考菌株的16S rDNA 序列系統(tǒng)進化樹（見圖1），結(jié)果表明，M1與鮑氏志賀菌（Shigella boydii）和宋氏志賀菌（Shigella sonnei）的同源性相近，判定M1屬于腸桿菌科細菌。

圖1 M1菌株與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹分析

2.4atpD 基因序列同源性與系統(tǒng)進化分析 將atpD 基因序列與GenBank 中相近序列進行比對，結(jié)果表明，M1 菌株與E.coli、鮑氏志賀菌（Shigella boydii）和宋氏志賀菌（Shigella sonnei）序列的同源性在99.9%以上（見表2）。利用MEGA6.0分子生物學軟件構(gòu)建M1 菌株和相關(guān)種的atpD 基因系統(tǒng)進化樹（圖2），表明M1分離株與志賀氏菌和E.coli的親緣關(guān)系較近。從功能基因同源性分析結(jié)果來看，M1 菌株與E.coli的同源性最高，鑒定M1菌屬于腸桿菌科大腸桿菌屬。

圖2 M1菌株與相關(guān)種的atpD基因序列系統(tǒng)進化樹分析

3 結(jié)論與分析

為明確從腹瀉肉雞病例中分離到的M1 菌株的生物學特性，本試驗進行了純化培養(yǎng)和生物學鑒定。結(jié)果顯示M1 菌落外觀呈白色凸起，鏡下外觀為兩端橢圓桿狀G-菌；結(jié)合生化試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)M1 菌株符合大腸桿菌的生化特性，與由佳等［6］研究的結(jié)果一致。分子檢測方法在細菌鑒定中具有高度特異性和敏感性特征，本研究借助16S rDNA 和功能基因atpD 基因序列進行類群及系統(tǒng)發(fā)育分類，并與GenBank 中相近序列進行比對，結(jié)果顯示M1 菌株與E.coli、志賀菌等種的序列同源性在99%以上，進化樹分析得出M1 與鮑氏志賀菌和宋氏志賀菌的家族關(guān)系較近。綜合傳統(tǒng)細菌鑒定、生理生化試驗與16S rDNA、atpD 基因進化分析結(jié)果，證實所分離M1菌屬于大腸桿菌。