李星 劉東升 杜鋼

(巴彥淖爾市醫(yī)院放療科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000)

肺癌是最常見的一種惡性腫瘤，男性發(fā)病率較高，是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。隨著肺癌發(fā)病率日益升高，其已經(jīng)從一種罕見的疾病轉(zhuǎn)變?yōu)槿蛐怨残l(wèi)生問題[3-4]。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌[5]，其治療主要是通過手術(shù)、放療、化療，其中以順鉑為代表的鉑類抗腫瘤藥是治療非小細(xì)胞肺癌的一線化療藥[6-7]，順鉑可引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷從而介導(dǎo)多種細(xì)胞信號通路抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。但順鉑的耐藥現(xiàn)象逐漸加劇[9]，給臨床治療帶來困難。目前對順鉑耐藥的機(jī)制尚不明確。因此，探討順鉑耐藥的機(jī)制對肺癌的治療具有重要影響。近年研究發(fā)現(xiàn)，真核翻譯起始因子5A-2(Eukaryotic Translation Initiation Factor 5A-2，eIF5A-2)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)eIF5A-2高表達(dá)并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過程[10]，但eIF5A-2對肺癌細(xì)胞耐藥性的影響鮮有報(bào)道。本研究采用小干擾RNA(Small Intemring RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染人肺癌A549/DDP細(xì)胞，探討抑制eIF5A2對A549/DDP細(xì)胞耐藥性的影響并分析其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 人肺癌細(xì)胞株A549/DDP(貨號ZQ0461)購自上海中喬新舟生物科技有限公司；引物、eIF5A-2-siRNA慢病毒均由上海吉?jiǎng)P基因生物公司設(shè)計(jì)合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號14966005)均購自美國ThermoFisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號K1622)購自美國Fermentas公司；Trizol(貨號46301)購自美國Sigma公司；兔抗人單克隆eIF5A2抗體(貨號ab150439)、兔抗人多克隆LC3 Ⅱ抗體(貨號ab51520)、兔抗人單克隆Beclin-1抗體(貨號ab207612)購自美國Abcam公司。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀(型號SpectraMax iD3)購自上海美谷分子儀器有限公司；電泳儀(型號1658001)購自美國Bio-Rad公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號ABI9700)購自美國ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549和A549/DDP細(xì)胞接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含1%雙抗，10% FBS)，置于37 ℃，0.5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入含500 ng/mL DDP藥物的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱，2～3 d換液，待細(xì)胞長滿消化傳代，進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組 取1.3.1細(xì)胞接種于以2×105個(gè)/孔接種于24孔板，細(xì)胞融合至60%時(shí)轉(zhuǎn)染，按照慢病毒轉(zhuǎn)染說明書操作，實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對照組(人肺癌細(xì)胞A549)，空白對照組(人肺癌細(xì)胞A549/DDP)：不采用病毒轉(zhuǎn)染，陰性對照(Negative Control，NC)組：采用LV-NC-GFP轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞，eIF5A-2 SiRNA(SiRNA)組：采用LV-eIF5A-2-SiRNA-GFP轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 qRT-PCR檢測各組細(xì)胞eIF5A-2 mRNA相對表達(dá)水平 Trizol提取1.3.2中各組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對RNA合成cDNA，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性15 min、95 ℃變性10 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為對照，采用2-△△Ct法分析eIF5A-2 mRNA相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 MTT檢測DDP作用下A549/DDP細(xì)胞的耐藥性 1.3.2中細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96孔板24 h后加入終濃度為8 μg/mL DDP，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，設(shè)置調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL濃度5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO放于搖床震蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后在酶標(biāo)儀檢測570 nm處各孔的OD值。計(jì)算各組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549/DDP細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，每組加入終濃度為8 μg/mL DDP，48 h后收集細(xì)胞，按照Annex-in V-FITC凋亡試劑盒方法在流式細(xì)胞儀上檢測每組細(xì)胞的凋亡率。

1.3.6 單酰戊二胺(MDC)染色檢測細(xì)胞中自噬小體形成情況 1.3.2中細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h，常規(guī)消化離心，收集各組細(xì)胞用1×清洗緩沖液清洗細(xì)胞棄上清，重懸細(xì)胞并調(diào)整每組細(xì)胞至1×106個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液加至新EP管中，加入MDC染液，輕輕混勻，避光孵育30～40 min，用1×沖洗緩沖液清洗細(xì)胞2～3次，棄上清，收集細(xì)胞，加入抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中自噬小體的形成，統(tǒng)計(jì)自噬小體的數(shù)目。

1.3.7 Western blot法檢測eIF5A-2、LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白相對表達(dá)水平 收集1.3.2各組細(xì)胞，用含PMSF的RIPA裂解液冰水浴下裂解，提取蛋白，BCA法蛋白定量，按照4∶1在蛋白中加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱3～5 min，置于-20 ℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備12%分離膠和5%濃縮膠，以每泳道30 μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳，根據(jù)蛋白marker切膠，濕法轉(zhuǎn)膜，抗體LC3Ⅱ、Beclin-1、eIF5A-2均按照1∶1000的比例稀釋后與PVDF膜4 ℃孵育過夜，TBST清洗，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育并放搖床2 h，TBST清洗，參考ECL發(fā)光液說明書對條帶孵育、曝光、顯影。通過Image J軟件對條帶灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞eIF5A-2 mRNA表達(dá)水平 與正常對照組相比，空白對照組、NC組細(xì)胞中eIF5A-2 mRNA相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與空白對照組、NC組相比，eIF5A-2 SiRNA組細(xì)胞eIF5A-2 mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞中eIF5A-2 mRNA相對表達(dá)水平

2.2 eIF5A-2下調(diào)對A549/DDP細(xì)胞的耐藥性影響 與正常對照組相比，空白對照組、NC組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50顯著升高(P<0.05)；與空白對照組、NC組相比，eIF5A-2-SiRNA組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50顯著降低(P<0.05)，見圖2。

2.3 eIF5A-2下調(diào)對DDP作用下A549/DDP細(xì)胞的凋亡的影響 與空白對照組、NC組細(xì)胞相比，eIF5A-2-SiRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖3～4。

圖2 各組細(xì)胞DDP耐藥性

圖3 各組A549/DDP細(xì)胞凋亡情況

圖4 各組A549/DDP細(xì)胞凋亡率

2.4 eIF5A-2下調(diào)對A549/DDP細(xì)胞自噬水平的影響 與空白對照組、NC組細(xì)胞相比，eIF5A-2-SiRNA組細(xì)胞中自噬小體數(shù)目顯著減少(P<0.05)，見圖5～6。

2.5 eIF5A-2下調(diào)對A549/DDP細(xì)胞中eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組、NC組細(xì)胞相比，eIF5A-2-SiRNA組細(xì)胞eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)，見圖7～8。

圖5 各組細(xì)胞中自噬小體形成情況(200×)

圖6 各組A549/DDP細(xì)胞中自噬小體數(shù)目

圖7 Western blot檢測各組A549/DDP細(xì)胞中eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)

圖8 各組A549/DDP細(xì)胞eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達(dá)水平

3 討論

eIF5A2基因位于人類染色體3q26.2區(qū)[11]，其編碼的蛋白在真核生物組織和細(xì)胞中大量存在，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，在翻譯蛋白質(zhì)過程發(fā)揮起始和延伸作用。大量研究表明，eIF5A2蛋白在正常組織細(xì)胞中低表達(dá)，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能作為致癌因子發(fā)揮作用[12-13]。

肺癌的發(fā)病率高，預(yù)后差，對化療順鉑的耐藥性日益升高已經(jīng)成為臨床治療的難題，探討肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性機(jī)制具有極其重要的科學(xué)意義[14-15]。因此，本研究以人肺癌A549/DDP細(xì)胞株為研究對象檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組A549細(xì)胞相比，空白組、NC組A549/DDP細(xì)胞中elF5A2 mRNA相對表達(dá)水平明顯升高，提示elF5A2在人肺癌A549/DDP細(xì)胞中高表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，elF5A2抑制劑GC7與西妥昔單抗聯(lián)用可明顯提高上皮性肝癌細(xì)胞對西妥昔單抗的敏感性，提示GC7可能通過抑制elF5A2表達(dá)，促進(jìn)西妥昔單抗對肝癌細(xì)胞毒性[16]。Liu等[17]研究表明，RNA干擾沉默eIF5A-2可提高急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞對柔紅霉素的敏感性。此外，研究發(fā)現(xiàn)敲除eIF5A2基因可逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞對DDP的敏感性[18]。本研究通過轉(zhuǎn)染eIF5A-2 SiRNA沉默elF5A2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組、NC組相比，eIF5A-2-SiRNA組A549/DDP細(xì)胞eIF5A-2 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平顯著降低，提示elF5A2低表達(dá)模型建立成功。進(jìn)一步用不同濃度的DDP干預(yù)耐藥A549/DDP細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組、NC組相比，eIF5A-2-SiRNA組半數(shù)抑制濃度IC50顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示elF5A2下調(diào)可提高人肺癌A549/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

自噬是細(xì)胞處于營養(yǎng)缺乏或外界刺激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種自身保護(hù)機(jī)制，有助于細(xì)胞存活，細(xì)胞可通過自噬作用降解未折疊蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器，消化清除細(xì)胞內(nèi)垃圾，維持細(xì)胞內(nèi)代謝平衡[19-20]。此外，自噬參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、新陳代謝紊亂、神經(jīng)退行性變等病理過程，細(xì)胞自噬與腫瘤細(xì)胞的耐藥密切相關(guān)[21]。Xiao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，抑制熱休克蛋白HSP90AA1可抑制骨肉瘤細(xì)胞的自噬保護(hù)作用，增加細(xì)胞對耐阿霉素、順鉑和甲氨蝶呤藥等化療藥物的耐藥性。TXNDC17過表達(dá)可通過促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)細(xì)胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組、NC組細(xì)胞相比，eIF5A-2-SiRNA組A549/DDP細(xì)胞中自噬小體數(shù)目顯著減少，提示下調(diào)elF5A2表達(dá)可降低人肺癌A549/DDP細(xì)胞的自噬水平。自噬微管相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1在自噬體形成中起重要作用，LC3Ⅱ位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是自噬體形成的重要蛋白，LC3Ⅱ可與p62結(jié)合形成多聚泛素化蛋白-p62復(fù)合物，泛素化蛋白被解降，是檢測自噬活性的標(biāo)志蛋白之一[24]。Beclin-1作為啟動(dòng)自噬過程的關(guān)鍵蛋白，可正向調(diào)節(jié)自噬過程[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組、NC組細(xì)胞相比，eIF5A-2-SiRNA組A549/DDP細(xì)胞中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低，提示下調(diào)elF5A2表達(dá)可降低A549/DDP細(xì)胞中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)。

4 結(jié)論

elF5A2下調(diào)可降低人肺癌細(xì)胞株A549/DDP耐藥性，可能與下調(diào)LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞的自噬水平有關(guān)。elF5A2可能成為逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥的一個(gè)新靶點(diǎn)，為臨床治療肺癌對順鉑的耐藥性提供參考據(jù)。而本研究還存在一定的局限性，未對elF5A2下調(diào)抑制自噬的具體機(jī)制進(jìn)行分析，存在不足，后期將進(jìn)一步研究。