血站核酸檢測實驗室HBV DNA項目室內(nèi)質(zhì)量控制方法探討

文良雪， 張瀾藝， 蘇 麗， 王明芬， 劉永生

（遵義市中心血站，貴州 遵義 563000）

進行室內(nèi)質(zhì)量控制（internal quality control，IQC）是實驗室有效運行的需要，也是《血站實驗室質(zhì)量管理規(guī)范》[1]等我國醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)相關(guān)規(guī)定的強制要求。在實時進行實驗監(jiān)控的同時，還應(yīng)定期對結(jié)果進行匯總和回顧性分析，以確保IQC的有效運行。目前，我國血站血液篩查核酸檢測實驗室均各自采用不同的IQC方案，未見統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。為建立適合本實驗室的HBV DNA檢測IQC方法，本研究在日常使用陽性質(zhì)控品判定實驗是否在控的基礎(chǔ)上，結(jié)合陽性質(zhì)控品循環(huán)域值（cycle threshold，Ct）、陽性對照Ct值、內(nèi)標(biāo)Ct均值、內(nèi)標(biāo)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差的Levey-Jenning質(zhì)控圖、總體監(jiān)控指標(biāo)進行回顧性分析。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

收集遵義市2018年4月1日— 6月29日無償獻血者酶聯(lián)免疫吸附試驗非反應(yīng)性血液標(biāo)本14 172份。

1.2 儀器與試劑

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA陽性質(zhì)控品（1.0 mL/支，濃度200 IU/mL，批號20171106，北京康徹思坦公司），HBV、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（I型）核酸檢測試劑盒[聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaciton，PCR）熒光法，含陰、陽性對照，批號20171213，上?？迫A公司]，Microlab STAR全自動樣本處理儀（瑞士HAMILTON公司），ABI 7500實時熒光PCR擴增儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

采用8份標(biāo)本混檢模式，按照試劑盒說明書的操作步驟進行每日核酸檢測。每批實驗均含1個陽性質(zhì)控品、1個陽性對照和1個陰性對照。當(dāng)HBV DNA陽性質(zhì)控品、試劑盒陽性對照為反應(yīng)性，試劑盒陰性對照為陰性，且內(nèi)標(biāo)陽性時，判定該批實驗在控。

1.4 繪制Levey-Jenning質(zhì)控圖

在ABI 7500實時熒光PCR擴增系統(tǒng)中查得每批實驗的陽性質(zhì)控品Ct值、陽性對照Ct值、內(nèi)標(biāo)Ct均值、內(nèi)標(biāo)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差。以前20次檢測的數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)，用SPSS 18.0軟件繪制箱型圖進行離群值檢驗（剔除超過3s的數(shù)據(jù)），分別計算數(shù)據(jù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，用Excel 2007軟件繪制Levey-Jenning質(zhì)控圖。

1.5 回顧性分析

將前20次檢測以后每批次的實驗結(jié)果進行正態(tài)分布檢驗，用Excel 2007軟件把數(shù)據(jù)自動繪入Levey-Jenning質(zhì)控圖，使用Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法進行判斷。

1.6 總體監(jiān)控指標(biāo)分析

統(tǒng)計3個月的檢測標(biāo)本總數(shù)及混樣反應(yīng)性、拆分反應(yīng)性次數(shù)，并計算總體監(jiān)控指標(biāo)：混檢陽性率（混樣反應(yīng)性次數(shù)/標(biāo)本總數(shù)×100）、拆分陽性率（拆分反應(yīng)性次數(shù)/標(biāo)本總數(shù)×100）、拆出率（拆分反應(yīng)性次數(shù)/混樣反應(yīng)性次數(shù)×100）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 實驗在控判定結(jié)果

3個月的檢測數(shù)據(jù)中，每個批次實驗HBV DNA陽性質(zhì)控品、試劑盒陽性對照及陰性對照均符合判定規(guī)則，所有批次實驗均在控。

2.2 Levey-Jenning質(zhì)控圖繪制

統(tǒng)計ABI 7500實時熒光PCR系統(tǒng)中的實驗數(shù)據(jù)，計算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。繪制箱型圖進行離群值檢驗，均值未出現(xiàn)離群值。繪制Levey-Jenning質(zhì)控圖。見表1、圖1～圖4。

表1 前20次實驗均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)統(tǒng)計表

圖1 陽性質(zhì)控品Ct值Levey-Jenning質(zhì)控圖

圖2 陽性對照Ct值Levey-Jenning質(zhì)控圖

圖3 內(nèi)標(biāo)Ct均值Levey-Jenning質(zhì)控圖

圖4 內(nèi)標(biāo)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差Levey-Jenning質(zhì)控圖

2.3 回顧性分析結(jié)果

所有結(jié)果均服從正態(tài)分布，計算所有實驗累積均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)。見表2。

表2 累積均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)統(tǒng)計表

把前20次實驗后每批次的實驗數(shù)據(jù)自動繪入Levey-Jenning質(zhì)控圖，得到3個月的Levey-Jenning質(zhì)控圖，使用Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法進行判斷，陽性質(zhì)控品在第1、21、31天發(fā)生12s警告，第32天發(fā)生13s失控，第34天違背41s規(guī)則，第28～38天違背規(guī)則，見圖5。陽性對照在第17、19、35、40、42、44、46、48、50、60天發(fā)生12s警告，見圖6。內(nèi)標(biāo)Ct均值在第26、54天發(fā)生12s警告，第30、58天發(fā)生13s失控，見圖7。內(nèi)標(biāo)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在第2、26、30、57天發(fā)生12s警告，第27天發(fā)生22s失控，第58天發(fā)生R4s失控，見圖8。

圖5 陽性質(zhì)控品Levey-Jenning質(zhì)控圖

圖6 陽性對照Levey-Jenning質(zhì)控圖

圖7 內(nèi)標(biāo)Ct均值Levey-Jenning質(zhì)控圖

圖8 內(nèi)標(biāo)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差Levey-Jenning質(zhì)控圖

2.4 總體監(jiān)控指標(biāo)分析結(jié)果

3個月共檢測標(biāo)本14 172份，其中HBV DNA混樣反應(yīng)性13次，拆分反應(yīng)性8次，混檢陽性率、拆分陽性率和拆出率分別為0.092%、0.056%、61.540%。

3 討論

《血站技術(shù)操作規(guī)程（2019版）》[2]要求每批核酸檢測應(yīng)至少有1個外部質(zhì)控品，外部質(zhì)控品由第三方提供，建議濃度為檢測系統(tǒng)最低檢測限的2～5倍?？迫A系統(tǒng)8混檢模式HBV DNA檢測最低檢測限為50 IU/mL。本實驗室選擇的質(zhì)控品濃度為200 IU/mL，陽性對照為試劑盒陽性對照，設(shè)立質(zhì)控品和陽性對照的意義在于排除假陰性和進行實驗監(jiān)控，兩者不可相互替代；陰性對照可以排除假陽性。內(nèi)標(biāo)與靶標(biāo)DNA在同一反應(yīng)體系中同時進行核酸提取和擴增檢測，可以驗證實驗過程的可靠性，監(jiān)測其中是否存在PCR反應(yīng)的抑制物、降解核酸的酶或影響擴增反應(yīng)的雜質(zhì)等。質(zhì)控品、陽性對照結(jié)果為反應(yīng)性，陰性對照為陰性，且內(nèi)標(biāo)有效擴增，則認為該批實驗在控。在實時監(jiān)控進行IQC的同時，觀察質(zhì)控品、陽性對照、內(nèi)標(biāo)Ct值波動情況，進行回顧性分析，監(jiān)控實驗性能，發(fā)現(xiàn)批間變異，可反映實驗的有效性和穩(wěn)定性。

本研究質(zhì)控品和陽性對照Ct值變異系數(shù)分別為2.41%、0.49%，表示批間穩(wěn)定性較高，測定結(jié)果較一致。將質(zhì)控品和陽性對照Ct值聯(lián)合內(nèi)標(biāo)Ct值進行分析，結(jié)果可顯示反應(yīng)體系對靶標(biāo)核酸檢測值高低的影響。內(nèi)標(biāo)Ct均值反映了批內(nèi)實驗穩(wěn)定性集中趨勢，該值在29.89附近波動，且變異系數(shù)為0.70%，離散趨勢小。內(nèi)標(biāo)Ct標(biāo)準(zhǔn)差的變異系數(shù)為17.96%，說明批間存在一定的變異，應(yīng)嚴格監(jiān)控核酸檢測的實驗過程，采取適時進行儀器維護與保養(yǎng)、按說明書要求貯存和使用試劑、控制實驗室溫濕度、使用不間斷電源等措施，控制實驗條件，保證實驗精密度和準(zhǔn)確度。

實驗數(shù)據(jù)正態(tài)分布驗證結(jié)果顯示其服從正態(tài)分布，可采用Levey-Jenning質(zhì)控圖及相應(yīng)的質(zhì)控規(guī)則進行IQC。Levey-Jenning質(zhì)控圖可以直觀地顯示數(shù)據(jù)的分布，易于發(fā)現(xiàn)保存和使用過程中試劑性能的衰減情況（質(zhì)控品和陽性對照檢測值是否呈現(xiàn)連續(xù)走低趨勢等）及試劑批號更改對實驗的影響等。本研究使用同一批號的檢測試劑盒，該試劑盒性能良好，并未出現(xiàn)衰減趨勢。

Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法12s作為警告規(guī)則，對誤差檢出具有靈敏度高的特點，但識別特異性相對較低。因此觸發(fā)12s警告規(guī)則后，應(yīng)及時啟用13s→22s→R4s→41s→規(guī)則進行檢驗，13s和R4s規(guī)則可判定是否為隨機誤差，22s、41s、規(guī)則判定是否為系統(tǒng)誤差[2]。實驗中發(fā)生的12s警告，按Westgard“13s→22s→R4s→41s→”規(guī)則依次檢驗，未發(fā)生失控。質(zhì)控品Ct值在第32天測定值超出x-3s控制線，違背13s規(guī)則，分析其原因，可能為質(zhì)控品復(fù)融沒有在室溫條件下放置足夠長的時間導(dǎo)致了濃度不均、上樣前震蕩混勻不充分等，但該批實驗陰、陽性對照和質(zhì)控品均有效，該批檢測結(jié)果是可接受的；第28～38天違反41s和規(guī)則，均在的下側(cè)，實驗有效，但警告應(yīng)對系統(tǒng)進行一定的維護；內(nèi)標(biāo)Ct均值在第30、58天超出+3s控制線，可能存在提取效率降低、提取純化不夠、有檢測抑制物的情況，也可能是試劑室溫平衡時間不夠、磁珠在上機前未充分混勻等所致；內(nèi)標(biāo)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在第27天發(fā)生22s失控、在第58天違背R4s失控，說明該批次內(nèi)標(biāo)Ct值波動較大，原因可能是儀器不穩(wěn)定、電壓波動、環(huán)境溫度和濕度變化大、擴增儀孔間溫度不均勻等。

本研究混檢陽性率為0.092%、拆分陽性率為0.056%，反映了血液篩查引入核酸檢測檢測后的功效，表明核酸檢測對于剔除病毒感染早期酶聯(lián)免疫吸附試驗非反應(yīng)性核酸陽性血液、提高輸血安全的價值。本研究拆出率為61.540%，其與核酸檢測檢測效能有關(guān)，可反映核酸檢測過程的穩(wěn)定性[3]。若混檢陽性率顯著升高，而拆分陽性率、拆出率卻有所下降，則提示實驗室檢測過程中污染風(fēng)險增高[4]，此時應(yīng)當(dāng)回顧排查所有可能導(dǎo)致污染的操作過程，進行實驗室環(huán)境監(jiān)測，并進一步評估污染風(fēng)險。對總體監(jiān)控指標(biāo)進行分析發(fā)現(xiàn)，與本實驗室上一年同期比較（混檢陽性率、拆分陽性率、拆出率分別為0.084%、0.040%、46.670%）數(shù)據(jù)均略有上升；與安徽蕪湖市中心血站（拆分陽性率為0.080%、拆出率為65.710%）[5]結(jié)果相當(dāng)，比河南省紅十字血液中心（0.035%、34.480%）[6]、江蘇淮安市中心血站（0.030%、42.420%）[7]、山東濰坊市中心血站（0.014%、44.400%）[8]略高?？赡芘c獻血者人群來源不同、地方病毒流行率不同等有關(guān)。

需要指出的是，本研究IQC方法可能并不完全適用于臨床PCR實驗室。因為采供血單位只需要篩出陽性即可，且出于提高血液安全、把漏檢率控制在最小、盡量降低輸血傳播傳染病風(fēng)險的考慮，采取的檢測策略比較激進[9]。而在臨床醫(yī)療機構(gòu)中，必須準(zhǔn)確定量，盡可能減少假陰性和假陽性，否則會給臨床診治帶來負面影響，危及患者安全。臨床機構(gòu)若按此方法，可能會導(dǎo)致臨床檢驗中心和ISO 15189外審專家對IQC開具不合格項。

綜上所述，在血站血液篩查日常檢測中使用HBV DNA陽性質(zhì)控品進行IQC實時監(jiān)控，并定期對陽性質(zhì)控品Ct值、試劑盒陽性對照Ct值、內(nèi)標(biāo)Ct均值、內(nèi)標(biāo)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差繪制的Levey-Jenning質(zhì)控圖進行回顧性分析，再結(jié)合日常檢測結(jié)果進行總體監(jiān)控指標(biāo)的統(tǒng)計分析，觀察實驗有效性和穩(wěn)定性，可以有效實施血站HBV DNA檢測的IQC，以達到及時采取預(yù)防措施或糾正措施進行持續(xù)改進的目的。