傅科鶴 范莉莉 陳慧穎

摘要：纖維素是自然界中分布最廣泛的一種生物質(zhì)能源，篩選能夠高效降解纖維素的菌株對(duì)于開(kāi)發(fā)利用這類物質(zhì)具有重要意義。從土壤中分離純化獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株TW063-3，通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定得出，該菌株為草酸青霉。通過(guò)單因素優(yōu)化試驗(yàn)尋找最佳培養(yǎng)條件，然后通過(guò)正交試驗(yàn)確定關(guān)鍵因子的最佳參數(shù)。篩選得出最佳培養(yǎng)條件：15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，200 r/min培養(yǎng)6 d。在最佳培養(yǎng)條件下，酶活性比優(yōu)化前提高了34.1%，達(dá)到524.4 U/mL。研究結(jié)果可為生物降解纖維素酶提供一定的理論及應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：纖維素酶;草酸青霉;培養(yǎng)基優(yōu)化

纖維素酶能夠?qū)⒆匀唤缰凶钬S富的生物質(zhì)能源——纖維素類物質(zhì)分解成可溶性單糖，從而為大批量生產(chǎn)生物燃料乙醇提供廉價(jià)原料[1]。經(jīng)過(guò)50多年的研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶已經(jīng)成為第四大工業(yè)酶種[2]，在生物能開(kāi)發(fā)、食品、畜牧業(yè)及工農(nóng)業(yè)廢棄物回收等多個(gè)領(lǐng)域都具有遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景[3]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，自然界中能分解纖維素的生物類群主要是細(xì)菌與真菌[4]。絲狀真菌是產(chǎn)纖維素酶非常重要的一大類群，能夠產(chǎn)生多種胞外纖維素酶[5]。里氏木霉是研究得較為清楚的產(chǎn)纖維素酶菌株，但是其生長(zhǎng)量相對(duì)較小，產(chǎn)酶量不能滿足工業(yè)中轉(zhuǎn)化纖維素的需求[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，青霉菌具有胞內(nèi)分泌組分齊全、纖維素酶活性高、易培養(yǎng)和生長(zhǎng)速度快的優(yōu)勢(shì)[7]，而且青霉源纖維素酶能產(chǎn)生比木霉源纖維素酶較多的β-葡萄糖苷酶[8]。

本研究從海灘邊土壤篩選獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的青霉菌株，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，旨在提高該菌株的纖維素酶產(chǎn)量，研究成果可為今后工業(yè)化應(yīng)用纖維素酶提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 剛果紅篩選培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配方為10 g/L羧甲基纖維素鈉，0.2 g/L剛果紅，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.01 g/L FeSO4·7H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，14 g/L瓊脂。

1.1.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配方為10 g/L羧甲基纖維素鈉，3 g/L蛋白胨，0.5 g/L酵母粉，4 g/L （NH4）2SO4，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.3 g/L CaCl2，0.5 g/L MgSO4·7H2O，2 g/L吐溫-80。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 土壤樣品從海洋和森林中采集，取5點(diǎn)采樣，混合為1個(gè)樣品。在樣品中加入適量純凈水后，加玻璃珠打散，取上層液體，稀釋后涂板篩選。

1.2.2 纖維素酶活性的測(cè)定 采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測(cè)定纖維素酶活性。對(duì)照（CK）處理方法：取1 mL菌液，煮沸（100 ℃、5 min）滅活后用冷水冷卻5 min，之后加入1 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液和3 mL DNS，混合均勻后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷卻5 min，然后在波長(zhǎng)（λ）為540 nm的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中測(cè)吸光度。

酶活性的測(cè)定：取1 mL菌液，加入1 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液，混合均勻后在37 ℃水浴鍋中水浴30 min，煮沸（100 ℃、5 min）滅活后用冷水冷卻 5 min，再加入3 mL DNS溶液，混合均勻后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷卻5 min。每組測(cè)定吸光度前用其對(duì)應(yīng)的CK清零后再測(cè)定540 nm處的吸光度，每瓶設(shè)3次重復(fù)。酶活性單位的定義：催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶量為1 U[9]。

酶活性（U/mL）=D540 nm×n×1 000/K。

式中：n為稀釋倍數(shù);K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.2.3 高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選 將菌株活化后接種至剛果紅初篩平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待初篩獲得的高產(chǎn)漆酶菌株活化產(chǎn)孢后，用3層擦鏡紙過(guò)濾獲得孢子，稀釋至1×104 個(gè)/mL，在每瓶培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝量50 mL）中接入1 mL孢子懸液，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d后測(cè)定酶活性。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.2.4.1 碳源的優(yōu)化 對(duì)經(jīng)搖瓶復(fù)篩得到的最佳菌株進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源分別取10 g/L羧甲基纖維素鈉、10%葡萄糖、10%淀粉、10%蔗糖進(jìn)行篩選，其余條件不變，發(fā)酵5 d后測(cè)定酶活性，確定最佳碳源。

1.2.4.2 氮源的優(yōu)化 將發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源改為最適碳源，分別取2 g/L硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、蛋白胨進(jìn)行初始發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源的篩選，其余條件不變，發(fā)酵5 d后，測(cè)定酶活性，確定最佳氮源。

1.2.4.3 pH值的優(yōu)化 取最適碳源和氮源，pH值分別設(shè)為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，其余條件不變，發(fā)酵5 d后，測(cè)定酶活性，確定最佳pH值。

1.2.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 選擇優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)2 d開(kāi)始，每天測(cè)定1次纖維素酶活性，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.4.5 正交優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇碳源、氮源、pH值和生長(zhǎng)時(shí)間，設(shè)計(jì)4因素4水平正交試驗(yàn)[10]，采用 L16（44）正交表。

1.2.5 菌種的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)的鑒定 將菌種TW063-3活化后，接1小塊菌餅到CYA平板上，于28 ℃培養(yǎng)3 d產(chǎn)孢后，挑取少量帶孢子的菌絲置于載玻片上，顯微觀察并拍照。

1.2.5.2 分子生物學(xué)鑒定 DNA提取參照生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech）DneasyPlant Mini Kit（50）的試劑盒。采用真菌18S rDNA通用引物ITS1f（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列，PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序后通過(guò)MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

本研究共分離純化164株菌株，通過(guò)初篩獲得6株纖維素酶活性最高的菌株（圖1）。復(fù)篩結(jié)果表明，菌株TW063-3（P=8.73e-10<0.01）的纖維素酶活性最高，為268.2 U/mL。因此，選取TW063-3進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株活化后接種于CYA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d產(chǎn)孢后，挑取菌絲進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。觀察發(fā)現(xiàn)，菌落呈灰綠色，邊緣為白色，多分生孢分散形成許多小菌落（圖2-A）;分生孢子梗多次分枝后出現(xiàn)多簇對(duì)稱或不對(duì)稱的小梗，形如掃帚，具有隔膜且多個(gè)分支。分生孢子大多為球形和橢圓形，生長(zhǎng)時(shí)為藍(lán)綠色（圖2-B～圖2-D），因此初步鑒定TW063-3為青霉菌。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 TW063-3序列通過(guò)NCBI

BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，通過(guò)MEGA 7的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖3可以看出，TW063-3與草酸青霉的同源性都為99%，可靠性為100%。綜合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定TW063-3為草酸青霉（NCBI登錄號(hào)：MT020385）。

2.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 最佳碳源 如圖4所示，以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源時(shí)，纖維素酶活性最高，為33015 U/mL（P=0.016 7<0.05）。而葡萄糖和淀粉2種碳源產(chǎn)酶活性差異不顯著。因此選擇羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）作為最佳碳源。

2.3.2 最佳氮源 如圖5所示，以硝酸銨為氮源的酶活性與除蛋白胨外其他3種氮源的差異不顯著，但是其生長(zhǎng)量（P=0.004 24<0.01）比其他3種氮源高（圖6）。因此，選擇硝酸銨作為最佳氮源。

2.3.3 最適pH值 pH值為3.5時(shí)，酶活性顯著低于其他4種pH值（P=0.000 154<0.01），pH值為4.0的酶活性與pH值4.5、5.0時(shí)差異顯著，pH值為4.5、5.0、5.5的酶活性差異不顯著，其中pH值為5.0時(shí)酶活性最高。因此，選則pH值5.0為產(chǎn)酶的最佳pH值，酶活性為300.9 U/mL（圖7）。

2.3.4 最佳培養(yǎng)時(shí)間 確定該菌株最佳培養(yǎng)基后，從培養(yǎng)2 d開(kāi)始，每天測(cè)定1次菌株所產(chǎn)纖維素酶活性，培養(yǎng)7 d結(jié)束。如圖8所示，TW063-3菌株在培養(yǎng)4 d時(shí)酶活性最高，在培養(yǎng)5 d時(shí)酶活性下降，但是培養(yǎng)6 d又開(kāi)始上升，在培養(yǎng)7 d開(kāi)始小幅度下降。而培養(yǎng)4 d與培養(yǎng)6 d的酶活性差異不顯著，培養(yǎng)6 d與培養(yǎng)3 d的酶活性差異不顯著，培養(yǎng) 2 d 與培養(yǎng)7 d的酶活性差異不顯著，培養(yǎng)4 d的酶活性為300.42 U/mL，高于培養(yǎng)6 d的酶活性。因此， 選擇培養(yǎng) 4 d 作為 TW063-3 產(chǎn)纖維素酶的最

佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.3.5 正交優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇羧甲基纖維素鈉（A，設(shè)5、10、15、20 g/L 4個(gè)水平）、硝酸銨（B，設(shè)2、4、6、8 g/L 4個(gè)水平）、pH值（C，設(shè)3、4、5、6 4個(gè)水平）和培養(yǎng)時(shí)間（D，設(shè)3、4、5、6 4個(gè)水平）設(shè)計(jì)4因素4水平正交試驗(yàn)，采用 L16（44） 型正交設(shè)計(jì)。正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析表明，影響酶活性的4個(gè)因素排序?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間（D）>pH值（C）>碳源（A）>氮源（B），對(duì)于A因素，由于k3>k1>k4>k2，所以取A3，同理，B因素取B1，C因素取C1，D因素取D4，其最優(yōu)組合為A3B1C1D4（表1），即產(chǎn)纖維素酶最佳培養(yǎng)基組合為15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，培養(yǎng)時(shí)間為6 d。

由于正交極差分析表中培養(yǎng)組合為A1B4C1D4的酶活性最高，因此選取A1B4C1D4、A3B1C1D4的培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，組合A3B1C1D4的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的TW063-3產(chǎn)生的纖維素酶活性高達(dá)524.4 U/mL。由此，確定培養(yǎng)條件的最佳組合為A3B1C1D4。

3 結(jié)論

纖維素是自然界中分布最廣、產(chǎn)量最大的多糖類物質(zhì)，由于其多糖結(jié)合的高聚合性及復(fù)雜性，導(dǎo)致這類最豐富的資源一直無(wú)法得到充分開(kāi)發(fā)利用。

近幾十年來(lái)，相關(guān)研究熱點(diǎn)一直集中于如何充分開(kāi)發(fā)利用這類資源[11-12]，而篩選1株高產(chǎn)纖維素酶的菌株是纖維素資源充分開(kāi)發(fā)利用的基礎(chǔ)工作，相關(guān)成果將為纖維素的利用奠定理論依據(jù)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、放線菌與真菌等多種生物都能夠分泌豐富的纖維素復(fù)合酶體系為分解利用纖維素提供能量[13]。其中真菌纖維素酶由于種類全、活性高、作用底物廣等特點(diǎn)被廣泛開(kāi)發(fā)成商業(yè)化的酶系[14]。

本研究從廈門(mén)海灘邊土壤中分離出的1株能夠高效分解纖維素的絲狀真菌TW063-3，通過(guò)一系列形態(tài)學(xué)分析及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為青霉屬真菌。通過(guò)單因素優(yōu)化結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定該菌株最佳產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件為15 g/L羧甲基纖維素鈉+2 g/L硝酸銨，pH值為3.0，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為6 d。優(yōu)化后的酶活性比優(yōu)化前提高了34.1%，達(dá)到524.4 U/mL。研究成果為進(jìn)一步研究纖維素酶降解機(jī)制及工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)酶提供一定的理論基礎(chǔ)。

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