打頂涂抹生長素對烤煙上部葉內(nèi)源激素和光合作用的影響

劉一凡，李淮源，單雪華，雷 佳，姚 強，葉衛(wèi)國，郭 維，陳建軍

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草研究室，廣東 廣州 510642；2 湖南省煙草公司衡陽市公司，湖南 衡陽 421001；3 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣東 廣州 510385)

打頂是烤煙生產(chǎn)中一項必要的田間管理措施，是調(diào)控?zé)熤晟L、提高煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。由于打頂消除了頂端優(yōu)勢，使煙株的物質(zhì)代謝中心發(fā)生變化，腋芽快速生長，生產(chǎn)上一般使用抑芽劑來抑制腋芽生長。然而抑芽劑的使用會對烤煙和土壤環(huán)境帶來安全性方面的危險，增加吸食的潛在危害性，不符合“綠色煙草”的發(fā)展要求[1]。打頂同時改變了烤煙的“庫-源”關(guān)系，引起煙株內(nèi)源激素含量的變化，打破了煙株內(nèi)源激素的平衡[2]，而缺少“頂端優(yōu)勢”的烤煙無法有效誘調(diào)營養(yǎng)至上部葉，導(dǎo)致上部葉內(nèi)含物質(zhì)少，煙葉小而輕，開片度也較低[3]。

烤煙的生理代謝過程與植物內(nèi)源激素有關(guān)[4]。植物體內(nèi)激素種類繁多，各種激素通過相互促進或者相互拮抗的方式對植物的生長發(fā)育進行調(diào)控[5-6]。目前有關(guān)生長素與烤煙的研究主要集中在生長素對烤煙化學(xué)品質(zhì)的影響[7-8]，生長素的使用方式也以噴施為主[9]。光合效率是影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素，目前有關(guān)烤煙光合特性的研究主要集中在氮肥水平[10]、客土[11]和種植密度[12]等方面，缺乏內(nèi)源激素與光合特性相關(guān)性的研究。李春儉[13]指出，植物頂端產(chǎn)生或外源施用的生長素可將植物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)向生長素產(chǎn)生或施用的部位，從而使植株的莖頂端在一定程度上繼續(xù)保持頂端優(yōu)勢，并抑制側(cè)芽生長。外源激素是對內(nèi)源激素的補充[14]。本研究以烤煙品種‘K326’為材料，在打頂傷口處涂抹生長素，在煙株建立“人工頂端”，分析打頂涂抹生長素對烤煙內(nèi)源激素和光合特性的影響，探索調(diào)控上部煙葉生長的技術(shù)和方法，以期為今后優(yōu)質(zhì)上部葉的生產(chǎn)提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試烤煙(NicotianatabacumL.)品種為‘K326’，其種子由廣東煙草韶關(guān)市有限公司提供。供試化學(xué)試劑吲哚乙酸(分析純)，購自上海麥克林生化科技有限公司；超高效液相色譜儀-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司生產(chǎn)；Li-6400型光合作用儀，美國Li-COR公司生產(chǎn)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019年在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地進行，采用隨機區(qū)組設(shè)計，以生長素用量為試驗因素，設(shè)置4個處理：常規(guī)打頂，打頂傷口不施用生長素(CK)；打頂時于傷口處涂抹0.5 mg 的25 mg/kg生長素(T1)；打頂時于傷口處涂抹0.5 mg 的50 mg/kg生長素(T2)；打頂時于傷口處涂抹0.5 mg的100 mg/kg 生長素(T3)。每個處理重復(fù)3次。每個小區(qū)面積60 m2，株距0.6 m，行距1.2 m，種植100株，共12個小區(qū)，小區(qū)四周設(shè)兩行保護行。1月1日育苗，3月23日移栽，5月31日打頂。打頂前每個小區(qū)隨機選取9株煙株，留葉16 片，統(tǒng)一打頂后按試驗設(shè)計涂抹生長素，并掛牌標(biāo)記。其他田間管理按照優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)方案執(zhí)行。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 煙葉內(nèi)源激素含量測定 分別于涂抹生長素后第7，14，21，28，35天上午10:00-11:00，摘取處理煙株自上而下第3葉位煙葉，放入液氮速凍，帶回實驗室，在超低溫-80 ℃下保存。取保存煙葉，參考陳千思等[15]的方法提取內(nèi)源激素，采用HPLC-MS/MS分析測定吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)的含量。HPLC-MS/MS質(zhì)譜條件見表1。

表1 煙葉內(nèi)源激素含量測定的HPLC-MS/MS質(zhì)譜條件Table 1 HPLC-MS/MS analysis of mass spectrometry conditions for determination of endogenous hormones in tobacco leaves

1.3.2 煙葉光合特性測定 分別于涂抹生長素后第0，7，14，21，28，35天上午10:00-11:00，選取處理煙株自上而下第3葉位煙葉，使用Li-6400型光合作用儀測定凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)，人工控制光照強度為1 000 μmol/(m2·s)，CO2濃度為400 μmol/mol。

1.3.3 煙葉農(nóng)藝性狀測定 分別于涂抹生長素后第7，14，21，28，35天選取處理煙株自上而下第3葉位煙葉，用卷尺測量葉長和葉寬，計算開片度和葉面積。

開片度=葉寬/葉長×100%，

葉面積=0.634 5×葉長×葉寬。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013整理試驗數(shù)據(jù)和繪圖，采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 打頂涂抹生長素對烤煙上部葉內(nèi)源激素含量的影響

打頂涂抹生長素對烤煙上部葉內(nèi)源激素含量的影響見圖1。

圖1 打頂涂抹生長素對烤煙上部葉內(nèi)源激素含量的影響Fig.1 Effect of auxin application on topping wound on endogenous hormones content of upper leaves of flue-cured tobacco

由圖1可以看出，烤煙上部葉IAA含量隨著生育期的推移呈上升趨勢，處理后28 d時達到最大值，之后降低。在打頂涂抹生長素28 d時，涂抹50 mg/kg生長素的烤煙上部葉IAA含量達到了441.18 ng/g，較對照增加了88.72%。在其他時間點，涂抹生長素處理IAA含量與對照處理差異不顯著。總體來說，打頂涂抹生長素可以提高烤煙上部葉IAA含量。

烤煙上部葉IBA含量隨著生育期的推移呈“下降-上升-下降”趨勢變化。涂抹生長素處理IBA含量7～14 d時下降；14 d后IBA含量升高；在28 d時達到最大值，涂抹50 mg/kg生長素處理最高，較對照增加27.78%，之后下降。在7和14 d，涂抹生長素處理IBA含量高于或顯著高于對照，表明涂抹生長素可提高烤煙上部葉IBA含量。

烤煙上部葉ABA含量隨生育期的推移呈“雙峰”趨勢變化，在14和28 d時出現(xiàn)峰值。在涂抹生長素后7 d，煙葉ABA含量低于對照，在14 d時50 mg/kg生長素處理顯著低于對照，28 d后各生長素處理ABA含量均低于對照。說明打頂涂抹生長素降低了烤煙上部葉的ABA含量，在一定程度上延緩葉片的衰老。

隨著生育期的推移，涂抹生長素處理烤煙上部葉SA含量呈下降趨勢。在處理后7 d，生長素處理SA含量均顯著高于對照，其中涂抹50 mg/kg生長素的烤煙上部葉SA含量達到了2 722.95 ng/g，較對照增加122.75%。在14 d后，對照SA含量均高于涂抹生長素處理，且在14和28 d時差異顯著，表明打頂涂抹生長素降低了烤煙上部葉SA含量。

2.2 打頂涂抹生長素對烤煙上部葉光合特性的影響

由圖2可以看出，打頂涂抹生長素對烤煙上部葉光合特性有明顯影響。隨著生育期的推移各處理烤煙上部葉Pn呈“下降-上升-下降”趨勢變化。在處理7 d后，對照Pn顯著低于各處理；在21 d后涂抹50 mg/kg生長素烤煙上部葉Pn最高，達到了22.5 μmol/(m2·s)，較對照增加63.99%?？傮w來說，打頂涂抹生長素可以提高烤煙上部葉Pn，有利于烤煙上部葉有機物的合成。

圖2 打頂涂抹生長素對烤煙上部葉光合特性的影響Fig.2 Effect of auxin application on topping wound on photosynthesis of upper leaves of flue-cured tobacco

隨著生育期的推移各處理Gs變化趨勢一致，均表現(xiàn)為“下降-上升-下降-上升”趨勢。在7 d后，涂抹生長素處理Gs均高于對照；在14 d后涂抹50 mg/kg生長素烤煙上部葉Gs達到了530.33 μmol/(m2·s)，較對照增加23.17%。總體來說，打頂涂抹生長素可以在一段時間內(nèi)提高烤煙上部葉Gs，但是隨著生育期的推移，效果逐漸降低。

隨著生育期的推移各處理Ci變化趨勢一致，表現(xiàn)為“下降-上升-平緩”趨勢。 各處理Ci在0～7 d迅速下降，7 d至21 d迅速升高，21 d后逐漸趨于平緩，且差異不顯著。總體來說，打頂涂抹生長素對烤煙上部葉Ci影響不顯著。

隨著生育期的推移各處理Tr呈下降趨勢。14～21 d，對照處理Tr迅速下降，而涂抹50 mg/kg生長素烤煙上部葉Tr上升；在21 d，涂抹50 mg/kg生長素烤煙上部葉Tr達到了4.9 mmol/(m2·s)，較對照增加44.97%，且差異顯著；在35 d，各處理無顯著差異?？傮w來說，打頂涂抹生長素可以減緩Tr的下降趨勢，涂抹50 mg/kg生長素可以推遲Tr下降。

2.3 打頂涂抹生長素烤煙葉片內(nèi)源激素與光合特性的相關(guān)性

由表2可以看出，烤煙上部葉IAA含量與Pn顯著正相關(guān)， IBA含量與Pn和Gs顯著正相關(guān)，ABA與Gs極顯著負相關(guān)。

表2 打頂涂抹生長素烤煙葉片內(nèi)源激素與光合特性的相關(guān)性Table 2 Correlation between endogenous hormones and photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco with auxin application on topping wound

2.4 打頂涂抹生長素對烤煙上部葉生長發(fā)育的影響

打頂涂抹生長素對烤煙上部葉生長發(fā)育的影響見圖3。

圖3 打頂涂抹生長素對烤煙上部葉生長發(fā)育的影響Fig.3 Effect of auxin application on topping wound on growth of upper leaves of flue-cured tobacco topping wound

由圖3可以看出，隨著生育期的推移烤煙葉片的長度和寬度呈上升趨勢，且各涂沬處理均高于對照。在35 d，涂抹50 mg/kg生長素的葉長和葉寬最高，達到了74.2和28.93 cm，較對照增加5.55%和11.27%，且差異顯著，而涂抹25和100 mg/kg生長素的葉長和葉寬與對照差異不顯著。

隨著生育期的推移涂抹25和50 mg/kg生長素烤煙葉片的開片度呈上升趨勢，且各涂抹處理高于對照，而7～14 d涂抹100 mg/kg生長素的開片度呈下降趨勢，之后呈上升趨勢。在35 d，涂抹生長素處理葉片的開片度差異不顯著，但均顯著高于對照，其中涂抹50 mg/kg生長素的開片度最高，達到了39%，較對照增加5.5%。

隨著生育期的推移烤煙葉片的葉面積呈上升趨勢，且各涂抹處理均高于對照。在7 d，涂抹50 mg/kg生長素的葉面積高于其余處理，且差異顯著。在35 d，涂抹50 mg/kg生長素的葉面積達到了1 362.23 cm2，較對照增加17.4%，且與對照差異顯著，而涂抹25和100 mg/kg生長素的葉面積與對照無顯著差異。

3 討 論

外源激素可以改變烤煙體內(nèi)各激素含量，從而引起烤煙光合生理發(fā)生改變。本試驗結(jié)果表明，打頂涂抹生長素可以提高烤煙上部葉的IAA和IBA含量，這與代曉燕等[16]的研究結(jié)果一致。在打頂涂抹生長素35 d時，各處理煙葉的IAA和IBA含量無顯著差異，這可能與外源生長素對烤煙內(nèi)源激素的影響具有時間限制有關(guān)。光合能力的不足是限制烤煙上部葉品質(zhì)的重要因素，光氧化是光合生產(chǎn)力與產(chǎn)量的重要限制因素。水稻幼葉的相關(guān)試驗表明IAA可緩解光氧化，而ABA則會加速光氧化[17]。通過打頂涂抹生長素可以提高烤煙上部葉的Pn，且IAA和IBA含量均與Pn顯著正相關(guān)，說明外源生長素可以提高烤煙上部葉光合生產(chǎn)能力，這與王玲等[18]通過施用外源生長素增加水稻劍葉Pn的結(jié)果相一致。本研究中ABA含量與Pn負相關(guān)，這與林勇明[19]的研究結(jié)論雷公藤光合作用與ABA含量呈正相關(guān)關(guān)系相反，這可能與植物種類及其生育期的不同有關(guān)。但涂抹生長素濃度過高，烤煙上部葉的Pn反而減少，甚至在一些時間段低于常規(guī)打頂?shù)腜n，這可能與IAA的兩重性有關(guān)。

植物頂端產(chǎn)生的IAA向下極性運輸時造成的濃度梯度可以決定礦質(zhì)元素和同化物質(zhì)在植物體內(nèi)的運輸方向和分布，并且IAA可以通過影響同化物在韌皮部的運輸機制來控制莖中的營養(yǎng)梯度[20-21]。打頂限制了光合產(chǎn)物向烤煙生殖生長點的運輸，使上部葉既是“源”又是“庫”，但同時摘除了IAA產(chǎn)生的部位，去除了煙株的“頂端優(yōu)勢”，使煙株體內(nèi)極性運輸?shù)腎AA減少，營養(yǎng)成分無法有效運輸至上部葉。打頂涂抹生長素在去除生殖生長的基礎(chǔ)上補充了煙株的IAA含量，使煙株重新建立“人工頂端優(yōu)勢”，這不僅提高了烤煙上部葉光合產(chǎn)物的積累，同時通過增加煙株體內(nèi)極性運輸?shù)腎AA，提高了光合主要產(chǎn)物蔗糖在韌皮部的裝入速率[22]，加強了營養(yǎng)物質(zhì)向上的誘調(diào)，使上部葉得到充分發(fā)育，增加了上部葉的葉長、葉寬和葉面積，有利于烤煙上部葉質(zhì)量的改善。本研究結(jié)果表明，涂抹50 mg/kg生長素后35 d烤煙葉長和葉寬較對照分別提高5.5%和11.27%，說明外源生長素對烤煙上部葉葉寬的增加強于葉長，有利于上部葉的開片。葉片傳導(dǎo)CO2和H2O的能力主要由Gs反映, 植物可以通過調(diào)節(jié)氣孔的開關(guān)和大小控制CO2和H2O的交換頻率[23]。ABA可以通過控制氣孔徑和應(yīng)激反應(yīng)基因表達限制CO2進入葉片，從而降低光合速率[24]。通過打頂涂抹生長素可以降低烤煙上部葉ABA含量，同時增加烤煙上部葉Gs，這與陳愛國等[25]的研究結(jié)果一致。說明打頂涂抹生長素可以逆轉(zhuǎn)由ABA引起的氣孔關(guān)閉或氣孔徑的減小，解除ABA對煙葉光合速率的限制，這與蠶豆上的研究結(jié)果一致[26]。但同時注意到，處理后14 d即各處理ABA含量的峰值，僅涂抹50 mg/kg處理IAA顯著低于常規(guī)打頂，這可能是因為只有適宜濃度的外源生長素可以有效且持續(xù)地減少煙葉內(nèi)ABA含量。

煙葉成熟的過程就是其衰老的過程，葉片衰老過程中常伴隨著內(nèi)源激素含量的變化[27]，而ABA具有促進煙葉衰老的作用[28]。小麥的相關(guān)試驗顯示，外源生長素可抑制衰老相關(guān)基因的表達, 延緩其葉片衰老進程[29]。植物衰老與其體內(nèi)多胺水平下降有關(guān)，而多胺廣泛存在于有激素參與的生長旺盛和分裂活躍的細胞組織中，并且可以起到清除自由基和穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)的作用。葉片中的IAA可以促進植物組織中游離多胺的合成，而ABA對其合成起抑制作用[30]。說明打頂涂抹生長素可以通過增加IAA含量、降低ABA含量延緩煙葉的衰老，加強烤煙上部葉光合作用的時間。

SA 是廣泛存在于植物體內(nèi)的一種小分子酚類化合物[31]。一些試驗認為SA可以提高烤煙超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性,以及抗壞血酸(AsA)含量，有利于清除活性氧的危害，延緩衰老，從而促進光合作用，加強葉片生物量的積累[32-33]。但是蠶豆的相關(guān)試驗則指出，SA通過抑制CAT活性和誘導(dǎo)NADPH氧化酶活性來誘導(dǎo)活性氧信號H2O2的產(chǎn)生，H2O2會通過抑制質(zhì)膜內(nèi)K+電流而介導(dǎo)SA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉[34]，而通過施用ABA合成抑制劑能阻斷SA誘導(dǎo)的H2O2積累和胞間Ca2+升高，進而阻斷SA誘導(dǎo)的葉片氣孔關(guān)閉[35]。本研究在打頂涂抹生長素7 d后，隨著外源生長素濃度的增加，烤煙上部葉SA含量呈上升趨勢，說明通過打頂涂抹生長素可以提高其抗氧化能力，以應(yīng)對打頂帶給煙株的脅迫；但是當(dāng)濃度過高，煙葉SA含量反而下降，且高于常規(guī)打頂水平；而之后脅迫減少，SA含量顯著降低，煙葉由于脅迫導(dǎo)致的氣孔關(guān)閉得到解除，恢復(fù)正常生長。

4 結(jié) 論

為提高烤煙上部葉可用性，本試驗通過在打頂傷口處涂抹生長素建立“人工頂端”，可以增加烤煙上部葉IAA和IBA的含量，減少ABA的含量，延緩衰老，加強光合產(chǎn)物積累，提高開片度和葉面積。在本試驗條件下，涂抹50 mg/kg生長素效果最好。