乜照燕，張亞楠，花 蕊，陳麗君，李 亮，吳海峰

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，河北石家莊 050010；3.河北省胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河北石家莊 050061)

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，Cy)是一種抗腫瘤藥物，常用于治療各種惡性腫瘤及自身免疫性疾病。Cy的生殖系統(tǒng)毒性越來(lái)越受到人們重視。已有研究顯示Cy可以造成雄性生殖系統(tǒng)損害[1]。動(dòng)物模型研究顯示Cy可以導(dǎo)致大鼠睪丸和附睪組織發(fā)生病理學(xué)改變[2]。白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種天然多酚類(lèi)物質(zhì)，主要存在于虎杖、葡萄和紅酒中[3]。RES具有多種生物學(xué)活性如抗腫瘤、抗炎、抗氧化等，成為目前體外和體內(nèi)研究的熱點(diǎn)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)RES通過(guò)激活沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirtuin1，Sirt1)保護(hù)造血細(xì)胞免受放療誘導(dǎo)的損傷[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)RES可以保護(hù)放療誘導(dǎo)的腸道損傷[6]。鑒于此，RES對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用尚待研究。此外，Cy屬于前體藥，需在體內(nèi)完成代謝才能發(fā)揮作用，其活性代謝產(chǎn)物4-過(guò)氧化氫環(huán)磷酰胺(4-Hydro-peroxy Cyclophosphamide，4-HC)可直接作用于細(xì)胞[7]。鑒于此，本研究選用4-HC作為體外毒性藥物，研究RES在改善化療導(dǎo)致精子損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2018年1月至2018年4月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診患者的正常精液標(biāo)本。年齡25～34歲，健康狀態(tài)良好，以女方輸卵管因素就診，無(wú)高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病，性功能狀態(tài)正常，實(shí)驗(yàn)參與者均簽署知情同意書(shū)。患者禁欲3～7 d，采用手淫法取精液，獲取全部精液于干凈容器，立即送精液檢查室，在室溫下精液完全液化后，依據(jù)世界衛(wèi)生組織人類(lèi)精液實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)第5版進(jìn)行各項(xiàng)精液參數(shù)分析[8]，收集正常精液標(biāo)本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.14-HC誘導(dǎo)精子細(xì)胞毒性作用濃度和RES保護(hù)作用濃度的選擇 取正常精液標(biāo)本進(jìn)行密度梯度離心后，調(diào)整精子濃度為20×106/mL，處理后精液每份取0.1 mL，加入終濃度(0、1.0、2.5、5.0、7.5 μmol/L) 4-HC (Cayman，19527)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)5個(gè)標(biāo)本，24 h后計(jì)數(shù)精子活力，伊紅苯胺黑染色計(jì)數(shù)精子存活率，選擇4-HC適合作用濃度。選用不同濃度(5、10、25、50、75 μmol/L)RES(VETEC，900386-5G)預(yù)處理2 h后，再加入按上述已確定的半抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)4-HC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)5個(gè)標(biāo)本，24 h后計(jì)數(shù)精子活力，伊紅苯胺黑染色確定精子存活率，確定RES保護(hù)作用濃度。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組確立4-HC誘導(dǎo)的精子細(xì)胞的毒性作用濃度和RES保護(hù)作用濃度后，將本實(shí)驗(yàn)研究分為4組：①對(duì)照組(CON)，精子不加任何藥物在培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h；②單純RES組，精子在含50 μmol/L RES(RES濃度按1.2.1確定)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h；③4-HC組，精子在含2.5 μmol/L 4-HC(4-HC濃度按1.2.1確定)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；④RES+4-HC組，50 μmol/L RES培養(yǎng)液預(yù)處理2 h后，加入2.5 μmol/L 4-HC繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別取上述4組標(biāo)本檢測(cè)精子活力、精子活率、精子氧化應(yīng)激水平和精子凋亡水平。

1.2.3精子活力、活率測(cè)定精子活力測(cè)定采用WHO 《人類(lèi)精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》第5版要求。精子活率采用伊紅-苯胺黑染色。使用移液器頭吸取10 μL各組處理后精液于干凈EP管內(nèi)，吸取10 μL伊紅-苯胺黑溶液在EP管內(nèi)充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置60 s。滴加上述混合液10 μL于載玻片上，制成涂片，室溫自然干燥后于×100油鏡下觀察。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)計(jì)數(shù)染色(膜不完整，淡紅色)和不染色(膜完整，白色)細(xì)胞的數(shù)目。為了達(dá)到可接受的低樣本誤差，每張玻片評(píng)估200個(gè)精子。

1.2.4氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定精液微量丙二醛(Malondialdehyde，MDA)精子膜脂類(lèi)過(guò)氧化反應(yīng)的程度以反應(yīng)產(chǎn)物MDA表示，MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。取待測(cè)精液0.1 mL為測(cè)定管，并設(shè)測(cè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管及標(biāo)準(zhǔn)空白管，按照說(shuō)明書(shū)操作，分別加入相應(yīng)試劑，450 nm處BioTek酶標(biāo)儀測(cè)定。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，取各組精子懸液，按照說(shuō)明書(shū)操作，分別于550 nm和412 nm BioTek酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.2.5精子凋亡測(cè)定將上述處理后的精子懸液加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)離心洗滌2次，離心后取精子沉淀100 μL放入試管中，加入FITC-AnnexinV 10 μL和PI 5 μL染色，室溫下避光靜置15 min后加400 μL孵育緩沖液，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。每次檢測(cè)至少5 000個(gè)精子。采用前向散射/側(cè)向散射設(shè)門(mén)來(lái)排除細(xì)胞碎片和細(xì)胞聚集的干擾。先通過(guò)散射光信號(hào)分選精子與細(xì)胞碎片，然后再在雙變量熒光信號(hào)散點(diǎn)圖上區(qū)分出活細(xì)胞、死亡細(xì)胞與凋亡細(xì)胞。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，綠色熒光(480～530 nm)采用FL1通道檢測(cè)，紅色熒光(580～630 nm)采用FL2通道檢測(cè)，陽(yáng)性細(xì)胞比率和平均熒光強(qiáng)度采用CellQuest軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 4-HC導(dǎo)致精子活力和存活率下降不同濃度4-HC(0、1.0、2.5、5.0、7.5 μmol/L)處理精子24 h后。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，隨著4-HC濃度的增加，精子活力和活率逐漸降低，呈劑量依賴(lài)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。按給藥濃度IC50標(biāo)準(zhǔn)，選擇2.5 μmol/L 4-HC為后續(xù)實(shí)驗(yàn)給藥濃度。

表1 4-HC對(duì)精子活力和活率影響

2.2 RES改善了4-HC導(dǎo)致的精子活力和活率下降

為了研究RES對(duì)4-HC誘導(dǎo)精子活力和活率的改善作用，加入4-HC前使用不同濃度的RES預(yù)處理，24 h檢測(cè)精子活力和活率。結(jié)果顯示：隨著RES作用濃度的增加，精子的活力和活率逐漸增加；RES濃度達(dá)50 μmol/L時(shí)，精子的活力和活率顯著升高，與2.5 μmol/L 4-HC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果提示RES預(yù)處理能改善4-HC誘導(dǎo)的精子損傷。在RES濃度為50 μmol/L時(shí)效果最佳，選擇50 μmol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度(P<0.05，表2)。

2.3 RES改善4-HC導(dǎo)致精子氧化應(yīng)激對(duì)各組氧化應(yīng)激水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，4-HC組精子MDA水平增高，SOD、GSH-Px酶活性顯著下降，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在RES+4-HC組，MDA水平降低，SOD、GSH-Px酶活性升高(P<0.05)，與4-HC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可見(jiàn)，RES預(yù)處理降低了4-HC誘導(dǎo)的精子氧化應(yīng)激產(chǎn)物產(chǎn)生，增強(qiáng)了抗氧化酶活性，起到保護(hù)精子的作用。

表2 RES預(yù)處理對(duì)4-HC誘導(dǎo)精子活力和活率的影響

表3 RES預(yù)處理對(duì)4-HC誘導(dǎo)精子氧化應(yīng)激水平的影響

2.4 RES改善了4-HC誘導(dǎo)的精子凋亡對(duì)各組精子進(jìn)行流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)，結(jié)果顯示，4-HC組精子凋亡情況(42.6%)，與對(duì)照組(6.8%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，RES+4-HC組精子細(xì)胞凋亡率明顯降低為14.0%，與4-HC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，RES預(yù)處理改善了4-HC誘導(dǎo)的精子凋亡(圖1)。

A：對(duì)照組；B：4-HC組；C：RES+4-HC組；D：RES組。

3 討 論

近年來(lái)，隨著惡性腫瘤年輕化的趨勢(shì)，探尋化療前保護(hù)性腺功能、減少性腺損傷或化療后提高生育力的補(bǔ)救治療顯得尤為重要。精準(zhǔn)醫(yī)療、化療方案改善、現(xiàn)代手術(shù)方式改進(jìn)以及精子和睪丸組織保存、輔助生殖技術(shù)的大力發(fā)展，使更多腫瘤患者能夠生育后代。目前，上述措施各有利弊，尚需進(jìn)一步探尋新的保護(hù)腫瘤患者生育力的方法。

研究認(rèn)為多數(shù)化療藥物會(huì)影響生育，約50%男性患者在化療結(jié)束后會(huì)出現(xiàn)少弱精子癥，其中烷化劑和鉑類(lèi)化療藥物對(duì)生育力影響最大[9]。氧化應(yīng)激損傷是化療藥物導(dǎo)致性腺損傷的原因之一。抗氧化劑應(yīng)用可以減弱氧化應(yīng)激對(duì)精子的損傷。劉波等[10]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)提高抗氧化能力可以改善Cy致精子濃度減少和活力降低的情況。李杜娟等[11]在灌注Cy小鼠的實(shí)驗(yàn)中，抗氧化劑維生素E組通過(guò)提高抗氧化酶水平改善了Cy誘導(dǎo)的睪丸組織損傷。RES由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在酚羥基，能有效清除羥基和過(guò)氧化物，防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化和活性氧對(duì)DNA的損傷[12]。RES能夠激活體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)SOD、CAT等酶活性，具有細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性的功能[13]。目前有一些研究證實(shí)RES在體外氧化應(yīng)激環(huán)境中對(duì)精子有一定的保護(hù)作用。王莉莉等[14]在精子優(yōu)選過(guò)程中加入RES，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RES顯著降低了精子優(yōu)選過(guò)程中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量。此外，RES通過(guò)降低精子氧化應(yīng)激水平，改善了氧化劑導(dǎo)致的精子膜完整性破壞并且增加了精子活力和受精能力[15]。但RES對(duì)化療藥物導(dǎo)致的精子損傷是否有保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首先采用Cy構(gòu)建精子損傷模型，結(jié)果顯示，隨著4-HC濃度增加，精子活力和存活率下降，在2.5 μmo1/L時(shí)精子活力下降至52.2%，根據(jù)藥物濃度選擇的IC50原則，將2.5 μmo1/L 4-HC作為后續(xù)研究濃度。RES+4-HC組，隨著RES濃度升高，精子活力得到提升，50 μmol/L RES對(duì)精子改善效果最佳，選擇50 μmol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。

氧化應(yīng)激可以造成精子結(jié)構(gòu)和功能損害，是導(dǎo)致男性不育的主要原因[16]。本研究進(jìn)一步評(píng)估了氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和抗氧化酶GSH-Px、SOD酶活性的變化，MDA是氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中產(chǎn)生的主要氧化應(yīng)激產(chǎn)物之一，對(duì)精子細(xì)胞有明顯損傷作用，是引起不育的常見(jiàn)代謝產(chǎn)物[17]。

本研究結(jié)果顯示，4-HC組MDA水平顯著上升，GSH-Px、SOD酶活性顯著下降。ROS破壞線(xiàn)粒體呼吸功能，降低線(xiàn)粒體膜電位，導(dǎo)致能量生成障礙使得精子活力進(jìn)一步下降[18]。高水平的ROS可損害線(xiàn)粒體膜，引起細(xì)胞色素C釋放觸發(fā)細(xì)胞凋亡[19]。本研究顯示4-HC組精子活力、存活率下降，流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子凋亡增加。我們推測(cè)4-HC誘導(dǎo)精子產(chǎn)生過(guò)量的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致精子發(fā)生高氧化應(yīng)激損傷，高濃度的ROS破壞精子線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致精子活力減弱，也加速生殖細(xì)胞的凋亡過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)RES預(yù)處理組GSH-Px、SOD氧化酶酶活性增加，MDA水平降低，RES組精子活力和活率得到改善，精子凋亡降低。在RES組，MDA水平顯著下降，GSH-Px、SOD酶活性上升。精子活力、存活率得到提高，流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子凋亡降低。由此可見(jiàn)，RES抵抗了過(guò)度氧化應(yīng)激對(duì)精子的損傷作用，從而改善了4-HC誘導(dǎo)的精子損傷。在一些其他體外研究中發(fā)現(xiàn)RES可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化功能，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷而延緩細(xì)胞死亡[20]。RES預(yù)處理通過(guò)抗氧化改善了4-HC誘導(dǎo)的精子損傷。

綜上所述，本研究為臨床腫瘤治療中應(yīng)用化療藥物的男性生育力保護(hù)提供了一定的依據(jù)。未來(lái)研究將進(jìn)一步闡明RES改善化療藥物對(duì)精子的損害機(jī)制和RES應(yīng)用安全性的問(wèn)題。