應(yīng)激因素對大鼠腸道菌群影響及機(jī)制研究

賀 星， 劉 衛(wèi)， 朱 斌， 嚴(yán)和中， 唐 郡

解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院 消化內(nèi)科，安徽 合肥 230031

應(yīng)激是指機(jī)體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境受到外來非特異性的刺激而出現(xiàn)的一種不協(xié)調(diào)狀態(tài)[1]，可影響下丘腦-垂體-腎上腺軸和自主神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致皮質(zhì)醇水平釋放增加[2-3]。應(yīng)激與腸道疾病，如炎癥性腸病、腸易激綜合征及其他功能性胃腸疾病密切相關(guān)[4-5]。而腸道微生物-腦-腸軸障礙可能是應(yīng)激導(dǎo)致腸道疾病的重要病理基礎(chǔ)[6]，提示應(yīng)激可通過影響腸道微生態(tài)引起腸道癥狀。但應(yīng)激如何作用于腸道菌群及其機(jī)制研究報道少見。本研究旨在探討應(yīng)激對大鼠腸道菌群變化的影響及可能機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取20只雌性SPF級Wistar大鼠為研究對象[7-8]，體質(zhì)量(160±10)g，購于北京科宇動物養(yǎng)殖中心。大鼠均被安置于獨立代謝籠內(nèi)，平衡飼養(yǎng)3 d。將大鼠隨機(jī)分為A組與B組，每組各10只。B組大鼠接受急-慢結(jié)合應(yīng)激刺激(7種慢性應(yīng)激，1種急性應(yīng)激)，A組大鼠不給予特殊干預(yù)。

1.2 實驗儀器與設(shè)備 光源實時控制儀(樂清彼華電器，型號CHNT)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司，型號DH5000)，動脈夾(北京合理科創(chuàng)，型號DMJ-1.6)，水平振蕩器(金壇市城西崢嶸實驗儀器廠，型號SHZ-82)，大鼠固定器(北京搏貝科技有限公司，型號BB-500GB)。

1.3 研究方法

1.3.1 應(yīng)激方法 采用急-慢應(yīng)激法[9]刺激大鼠，具體包括：夜間連續(xù)照明12 h，禁水24 h，45℃悶熱的環(huán)境中5 min，夾尾1 min，4℃寒冷的環(huán)境中3 min，食物剝奪24 h，水平振動(120次/min)40 min。每7 d隨機(jī)順序給予一次上述刺激，每連續(xù)2 d給予的刺激順序不能相同，使大鼠無法預(yù)知刺激的發(fā)生，連續(xù)刺激3周，然后休息1周。再給予1 h紙帶束縛前肩、前上肢、胸部，限制前上肢搔抓頭面部，但不限制其活動。

1.3.2 大鼠腸道癥狀檢測 采用避水應(yīng)激法[10]測量大鼠排便量。觀察記錄1 h排便粒數(shù)(干便)或者次數(shù)(濕便)。于試驗28～31 d連續(xù)記錄5次數(shù)值，取平均值。通過濾紙印記判斷濕便次數(shù)，記錄24 h內(nèi)大便總次數(shù)、濕便次數(shù)。于造模30 d記錄兩組大鼠濕便率。

濕便率=濕便數(shù)/總便數(shù)×100%

1.3.3 HE染色 取大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，按照固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、鋪片與撈片、烤片順序制備石蠟切片[11]。然后使用Olympus光學(xué)顯微鏡放大200倍觀察大鼠乙狀結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)是否完整，腺體及隱窩結(jié)構(gòu)是否缺失。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測大鼠糞便菌群。大腸桿菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌目的基因引物如下(5′to 3′)：大腸桿菌上游引物CGGCAACGAGCGCAACCC，下游引物CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC；雙歧桿菌上游引物GATTCTGGCTCAGGATGAACGC，下游引物CTGATAGGACGCGACCCCAT；乳酸桿菌上游引物AGCAGTAGGGAATCTTCCA，下游引物CACCGCTACACATGGAG。

1.3.5 蛋白免疫印跡法法檢測腸道組織中 claudin-1 按照總蛋白質(zhì)提取、蛋白濃度測定、配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、檢測的順序進(jìn)行[12]。claudin-1所需抗體(生產(chǎn)廠家為abcam；規(guī)格ab15098)；內(nèi)參β-actin抗體(生產(chǎn)廠家為abcam；規(guī)格ab8227)。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附法 離心靜脈血及糞便標(biāo)本，收集后置于-70℃低溫冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒(Boster，武漢博士德)檢測血清白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10、IL-8及腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)的水平。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠腸道癥狀比較 B組大鼠1 h排便量為(7.14±0.84)次，明顯高于A組的(0.82±0.42)次，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B組大鼠濕便率為(12.15%±0.85%)，明顯高于A組的0，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 兩組大鼠腸道主要菌群計數(shù)比較 B組大鼠雙歧桿菌、乳酸桿菌計數(shù)低于A組，大腸桿菌計數(shù)高于A組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠腸道主要菌群計數(shù)比較

2.3 兩組大鼠血清炎癥因子水平比較 B組IL-8、TNF-α高于A組， IL-10低于A組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意(P<0.05)。見表2。

2.4 兩組大鼠腸道組織claudin-1蛋白表達(dá)比較 B組claudin-1蛋白表達(dá)低于A組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意(P<0.05)。見圖1。

2.5 兩組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)比較 A組大鼠腸上皮完整，腺體正常，排列整齊，隱窩結(jié)構(gòu)存在。部分B組大鼠出現(xiàn)上皮變性、壞死，隱窩結(jié)構(gòu)消失，但是病變相對局限。見圖2。

3 討論

臨床中，壓力事件可引起或加重腹痛等消化道癥狀，急性壓力可導(dǎo)致內(nèi)臟感覺閾值降低[13]。結(jié)合目前腸道微生態(tài)與腸道疾病發(fā)病的相關(guān)研究，考慮應(yīng)激可能通過腦-腸-微生態(tài)軸導(dǎo)致消化道癥狀的發(fā)生[14]，但其具體機(jī)制仍未完全確定。本研究采用的應(yīng)激方法針對大鼠的睡眠、運動、飲食、情緒及感知，并且反復(fù)隨機(jī)刺激，旨在使大鼠產(chǎn)生一種應(yīng)激與適應(yīng)的相對平衡狀態(tài)。通過29 d的作用，大鼠出現(xiàn)了明顯的消化道癥狀，排便次數(shù)和濕便比例明顯升高，證明了應(yīng)激刺激在消化道疾病中的作用，與相關(guān)研究[15-16]結(jié)果一致。為了進(jìn)一步明確應(yīng)激對大鼠腸道菌群的影響，本研究分析比較了兩組大鼠腸道主要菌群的差異，B組腸道有益菌雙歧桿菌及乳酸桿菌低于A組，而大腸桿菌高于A組，提示應(yīng)激可以改變大鼠腸道菌群的構(gòu)成和比例。近年來，腸道菌群在腸道疾病發(fā)病機(jī)理中的作用備受關(guān)注[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性壓力可以通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[18-19]，與本研究結(jié)果一致，但是具體機(jī)制相關(guān)研究較少[20]。

表2 兩組大鼠血清炎癥因子水平比較

圖1 免疫印跡法檢測大鼠claudin-1蛋白表達(dá)

圖2 兩組大鼠結(jié)腸黏膜顯微結(jié)構(gòu)(a.B組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)；b.A組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)；HE×200)

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激刺激后的大鼠促炎因子IL-8、TNF-α明顯高于A組，抑炎因子IL-10低于A組，提示應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)炎性反應(yīng)，其原因可能是應(yīng)激因素通過激活促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子系統(tǒng)，作用于肥大細(xì)胞，產(chǎn)生促炎因子，導(dǎo)致腸道局部炎性反應(yīng)[21]。本研究對大鼠腸道黏膜微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，B組大鼠部分腸道黏膜出現(xiàn)上皮變性、壞死，部分結(jié)構(gòu)消失，在大鼠腸道黏膜沒有接受直接理化刺激的前提下，考慮該變化為炎性反應(yīng)造成。為了明確局部炎性反應(yīng)對大鼠腸黏膜屏障的影響，本研究分析了腸道組織緊密連接蛋白claudin-1[22]，claudin-1可反映腸黏膜的完整性[23]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B組大鼠claudin-1染色明顯淺于A組大鼠，提示B組大鼠腸道完整性受到破壞，腸黏膜屏障及腸黏膜完整性破壞，影響腸道菌群的定植環(huán)境，從而導(dǎo)致菌群失調(diào)。

綜上所述，應(yīng)激因素可以通過影響腸道菌群的種類和比例從而產(chǎn)生消化道癥狀，其機(jī)制可能與應(yīng)激導(dǎo)致的炎性反應(yīng)破壞腸黏膜屏障及腸黏膜完整性相關(guān)。