祁艷鳳 尚鳳芹 余云登 周金旭 王寧 王秀利

摘要 提取暗紋東方鲀肌肉的總RNA，采用RT-PCR的方法來克隆暗紋東方鲀MyoD基因的cDNA序列，并通過生物信息學分析，對該基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、亞細胞定位以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進行初步的分析和預測。結(jié)果顯示，該基因編碼區(qū)全長為846 bp，共編碼了281個氨基酸，編碼蛋白為親水性非跨膜類蛋白，無信號肽結(jié)構(gòu)，其亞細胞定位于細胞核中。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明其與紅鰭東方鲀同源性最高，親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞 暗紋東方鲀;MyoD基因;基因克隆;生物信息學

中圖分類號 S 917.4文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）08-0089-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.024

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning and Bioinformatics Analysis of MyoD Gene of Takifugu obscurus

QI Yan-feng，SHANG Feng-qin，YU Yun-deng et al （College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract The total RNA of Takifugu obscurus muscle was extracted，and the cDNA sequence of MyoD gene of Takifugu obscurus was cloned by RT-PCR method.And through bioinformatics analysis，preliminary analysis and prediction of the physicochemical properties，hydrophilicity and hydrophobicity，subcellular localization and protein structure of the protein encoded by the gene were carried out.The results showed that the full length of the coding region of the gene was 846 bp，which encoded a total of 281 amino acids.The encoded protein was a hydrophilic non-transmembrane protein with no signal peptide structure，and its subcellular location was in the nucleus.The results of phylogenetic tree analysis showed that it had the highest homology with the redfin puffer and the closest genetic relationship.

Key words Takifugu obscurus;MyoD gene;Gene cloning;Bioinformatics

生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族包括MyoD、MyoG、Myf5和Myf6 這4種調(diào)節(jié)因子，該家族在成肌細胞的發(fā)育和分化方面都起著絕對作用[1-6]。MyoD基因作為生肌調(diào)節(jié)因子家族中的重要一員，主要負責調(diào)控脊椎動物胚胎期的肌肉發(fā)育，促進骨骼肌的形成與分化，并可以通過多種途徑來達到激活肌肉轉(zhuǎn)錄的目的，從而促進成肌細胞的分化;如果MyoD基因缺失，可導致成肌細胞無法進行增殖和分化，從而影響個體正常的生長和發(fā)育[7-13]。暗紋東方鲀的可食用部位主要是肌肉，而MyoD基因?qū)∪馍L的調(diào)控作用是至關(guān)重要的，所以對暗紋東方鲀MyoD基因的研究對改良其肉質(zhì)有重要意義。

暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）別稱橫紋多紀鲀，屬于鲀形目、鲀科、東方鲀屬。暗紋東方鲀屬于暖溫性底層洄游性魚類，生活于近海地帶，在我國主要分布于黃海、東海、長江中下游區(qū)域。春季親魚溯河生殖洄游進入淡水江河直流進行繁殖，幼魚在淡水中成長[14]。暗紋東方鲀?nèi)赓|(zhì)雪白且少刺，味道尤為鮮嫩可口，不僅含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，而且還有多種人體所含的必需氨基酸以及其他營養(yǎng)物質(zhì)，自古就享有“魚中之王”和“菜肴之冠”的美名。在一些亞洲國家如中國、日本和朝鮮都有著久遠的食用暗紋東方鲀的飲食習慣，特別是在日本市場尤為暢銷，是我國十分重要的經(jīng)濟魚類。暗紋東方鲀能成功地在純淡水中養(yǎng)殖，有著很高的經(jīng)濟價值，所以暗紋東方鲀養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展是十分迅速的，目前養(yǎng)殖規(guī)模也比較大，其養(yǎng)殖區(qū)域正從沿海向內(nèi)地迅速擴展。近幾年，沿岸的河豚資源量因過度開發(fā)而表現(xiàn)出每年急劇減少的趨勢，為滿足市場的需求，就要擴大養(yǎng)殖河鲀的生產(chǎn)量[15-16]。目前在暗紋東方鲀的養(yǎng)殖技術(shù)方面研究比較廣泛，但對其基因水平的了解知之甚少，還沒有暗紋東方鲀MyoD基因組全序列的報道。該試驗使用反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR方法，對暗紋東方鲀MyoD基因進行克隆及生物信息學分析，研究其基因序列的結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系及理化性質(zhì)，以期為進一步探究魚類MyoD基因的結(jié)構(gòu)與功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自江蘇南通中洋集團，隨機選擇健康的3尾3月齡暗紋東方鲀幼魚作為基因克隆的試驗樣本;提取RNA的Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq酶均購自TaKaRa生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 暗紋東方鲀總RNA提取與cDNA鏈合成。

剪取適量的暗紋東方鲀肌肉，加入液氮后進行充分研磨，使用Trizol法來提取暗紋東方鲀的總RNA。提取后通過凝膠電泳檢測來驗證RNA純度是否可以用于后續(xù)試驗。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系為20 μL，反應條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，共1個循環(huán)，4 ℃保存。反應結(jié)束后將產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱以備后續(xù)試驗使用。

1.2.2 基因引物設(shè)計與合成。

參考紅鰭東方鲀的MyoD基因序列（NM_001032771）設(shè)計暗紋東方鲀MyoD基因 CDS區(qū)PCR引物。使用Primer Premier 5.0軟件來設(shè)計克隆基因編碼區(qū)全長所需的引物。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成，所合成的引物序列如表l所示。

1.2.3 基因克隆。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用RT-PCR方法進行目的片段的擴增，PCR反應體系（25 μL）為ddH2O 14 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL，上游引物MyoD-F和下游引物MyoD-R各1 μL，模板 4 μL，Taq酶0.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min進入循環(huán);94 ℃變性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計35個循環(huán)，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，結(jié)果所得條帶清晰符合測序要求，送往北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.4 編碼蛋白生物信息學分析。該研究主要使用了生物信息學分析網(wǎng)站（表2）來預測和分析了編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白跨膜區(qū)域、信號肽、親水性、疏水性、亞細胞定位、磷酸化位點、蛋白質(zhì)二三級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化樹，以期能夠為后續(xù)分析該基因的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。其中進化樹構(gòu)建中各物種氨基酸序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫，分別為紅鰭東方鲀（NP_001027941.1）、人（NP_002469.2）、斑馬魚（NP_571337.2）、羅非魚（XP_031601968.1）、金頭鯛（NM_030427111.1）、大口黑鱸（XP_643446.1）、非洲爪蟾（NP_001079366.1）、草魚（AFL56774.1）、大鼠（NP_788268.2）、豬（NP_001002824.1）、雞（NP_989545.2）、黃牛（NP_001035568.2）、綿羊（NP_001009390.1）、抹香鯨（XP_028357079.1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀總RNA提取及檢測

使用Trizol法提取暗紋東方鲀肌肉的總RNA，其凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的RNA效果比較好，沒有蛋白的污染。圖1所展示的就是凝膠電泳檢測條帶，5S、18S和28S這3條帶明亮清晰，且寬度也比較適宜，再通過使用分光光度儀進行檢測，結(jié)果顯示D260nm/D280nm的值位于1.8～2.0，表明暗紋東方鲀肌肉的RNA提取效果良好，可以用于之后的試驗研究。

2.2 基因克隆

通過PCR程序擴增所得到的目的產(chǎn)物的凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示。在750～1 000 bp出現(xiàn)了一條清晰的DNA特異條帶，與預測擴增片段大小一致。由北京六合華大基因科技有限公司測序，結(jié)果所得目的基因片段長度為846 bp。將測序所得結(jié)果通過NCBI中的Blast程序與紅鰭東方鲀基因組數(shù)據(jù)庫該基因全長序列進行對比后，二者相似度高達99%，僅在412 bp處發(fā)生1個堿基的變化（A→G），對應所編碼的氨基酸也由蘇氨酸變成了丙氨酸。

2.3 生物信息學分析

通過反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR對暗紋東方鲀MyoD基因的cDNA進行了克隆，得到了暗紋東方鲀MyoD基因CDS區(qū)序列。該編碼區(qū)長度一共為846 bp，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG、TAA。通過Primer Premier 5.0將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，共翻譯編碼281個氨基酸，對其所編碼蛋白繼續(xù)進行生物信息學分析。

2.3.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。登陸ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi- bin/protparam/ protparam）分析MyoD基因氨基酸理化性質(zhì)，結(jié)果表明，氨基酸總數(shù)為281，其中Ser、Leu和Arg含量較多，分別為16.0%、8.5%和7.8%，不含Pyl和Sec，帶負電的殘基總數(shù)（Asp + Glu）為35，帶正電的殘基總數(shù)（Arg + Lys）為32，分子式為C1321H2078N398O436S14，分子量為30 960.28 Da，脂肪指數(shù)為62.56，理論等電點為6.41，親水性平均值（GRAVY）為-0.667，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為70.51，為不穩(wěn)定蛋白。

2.3.2 蛋白跨膜區(qū)域預測。

通過TMHMM Sever v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）輸入暗紋東方鲀MyoD蛋白序列。暗紋東方鲀MyoD基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)如圖3所示，其中X軸代表氨基酸殘基的數(shù)目，Y軸表示跨膜結(jié)構(gòu)可能性的分值（概率）;紅色線（transmembrane）代表跨膜區(qū);藍色線（inside）代表在膜內(nèi)部的概率，概率極低;粉色線（outside）代表在膜外的概率，幾乎100%。由此可見，該蛋白不存在跨膜區(qū)，且該蛋白全部在膜外。

2.3.3 暗紋東方鲀MyoD基因編碼蛋白的信號肽分析。

利用軟件SignalP 5.0在線分析蛋白質(zhì)的信號肽，發(fā)現(xiàn)無信號肽（圖4），說明MyoD基因所編碼的不是分泌蛋白。

2.3.4 暗紋東方鲀MyoD蛋白的親水性/疏水性預測與分析。

利用位于Expasy的ProtScale在線分析軟件進行蛋白質(zhì)的親疏水性分析，Amino acid scale選擇默認的Hphob./Kyte & Doolittle，Window size設(shè)置為9，線性加權(quán)模型（圖5）。圖形的高峰值（正值）的區(qū)域體現(xiàn)的是疏水區(qū)域，而負值的“低谷”區(qū)域體現(xiàn)的是親水區(qū)域。正值越大的氨基酸具備更大的疏水性，負值越小的氨基酸則具備更大的親水性。通過對圖5的分析可得，該蛋白的氨基酸在97位處有最大值（1.544），在75和76位處有最小值（-2.533），MyoD蛋白表現(xiàn)為親水性。

2.3.5 蛋白亞細胞定位分析。

利用PSORT Ⅱ Prediction軟件對暗紋東方鲀MyoD蛋白進行亞細胞定位分析，結(jié)果顯示，該蛋白在細胞核中分布最多，為56.5%;在細胞骨架中分布最少，為8.7%;細胞質(zhì)和線粒體分別為21.7%和13.0%。

2.3.6 暗紋東方鲀MyoD蛋白的磷酸化位點預測。

利用NetPhos 3.1軟件來預測其磷酸化位點，在暗紋東方鲀MyoD基因編碼的氨基酸中共發(fā)現(xiàn)有82個Ser磷酸化位點、15個Thr磷酸化位點、5個Tyr磷酸化位點（圖6）。

2.3.7 基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測。

2.3.7.1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測。

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和各功能取決于其空間結(jié)構(gòu)，利用PSIPRED在線分析軟件對MyoD蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測（圖7），從圖7可以看出二級結(jié)構(gòu)預測的置信度（Conf）、二級結(jié)構(gòu)圖標（Cart）、二級結(jié)構(gòu)字符表示（Pred）和氨基酸序列及編號（AA）。暗紋東方鲀MyoD基因編碼蛋白序列中只含有α螺旋（Helix）、無規(guī)則卷曲（Coil）和β折疊（Strand），不含有β轉(zhuǎn)角以及其他已知的結(jié)構(gòu)域。2.3.7.2 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測。

登陸SWISS-MODEL網(wǎng)站（https：//www.swissmodel.ex-pasy.org/）預測該基因編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，預測結(jié)果如圖8所示。

2.3.8 系統(tǒng)進化樹。

使用MEGAX分子遺傳進化分析軟件，對暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）和人（Homo sapiens）、斑馬魚（Danio rerio）、羅非魚（Oreochromis aureus）、金頭鯛（Sparus aurata）、大口黑鱸（Micropterus salmoides）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、大鼠（Rattus norvegicus）、豬（Sus scrofa）、雞（Gallus gallus）、黃牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）、抹香鯨（Physeter catodon）14個物種以臨近相連算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，紅點為暗紋東方鲀分支。由進化樹可表明，暗紋東方鲀與紅鰭東方鲀的親緣關(guān)系最近;其次為羅非魚、大黑口鱸、金頭鯛。

3 討論與結(jié)論

MyoD基因第一次被成功克隆出來是由Davis在1987年所完成的。作為生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族的主要成員之一，MyoD基因不論是對骨骼肌的形成還是分化都起著十分重要的作用[17-19]。該研究首次克隆并測出暗紋東方鲀MyoD基因的CDS區(qū)核苷酸序列，進而對其進行了生物信息學分析，得到其片段長度為846 bp，共編碼281個氨基酸，這與紅鰭東方鲀MyoD基因編碼區(qū)一致。該試驗結(jié)果顯示，暗紋東方鲀MyoD基因A、G、T、C堿基分別為21.40%、26.12%、18.44%和34.04%，與紅鰭東方鲀MyoD基因堿基序列相似度為99%，僅在412 bp處有堿基A→G的變化，這一堿基的突變引起了氨基酸序列的改變，因此該位點突變應為錯義突變。將該序列與其他物種的MyoD基因進行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暗紋東方鲀與紅鰭東方鲀同源性最高，與哺乳動物的同源性較低。這與傳統(tǒng)的生化特征分類和形態(tài)學分類的進化地位是相符合的，進一步說明 MyoD基因在對物種與物種間的系統(tǒng)進化關(guān)系的研究中是具有一定價值的[20-24]。

生物信息學分析結(jié)果顯示，暗紋東方鲀MyoD基因分子量為30 960.28 Da，理論等電點為6.41，親水性平均值（GRAVY）為-0.667，脂肪指數(shù)為62.56，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為70.51，其多肽鏈表現(xiàn)出親水性，為不穩(wěn)定蛋白。通過軟件TMHMM和SignalP 5.0在線分析可知，MyoD蛋白全部在膜外且不存在跨膜區(qū)也無信號肽，說明其不是分泌蛋白，這個結(jié)果與MyoD基因只在骨骼肌細胞特異表達的組織特異性一致。二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，暗紋東方鲀MyoD基因編碼蛋白序列中只含有α螺旋（Helix）、無規(guī)則卷曲（Coil）和β折疊（Strand），不含有β轉(zhuǎn)角以及其他已知的結(jié)構(gòu)域。由于暗紋東方鲀MyoD三級結(jié)構(gòu)僅有部分模型，因此無法預測完整的三級結(jié)構(gòu)。在線預測發(fā)現(xiàn)，MyoD基因存在磷酸化位點共102個，其中有82個Ser磷酸化位點、15個Thr磷酸化位點、5個Tyr磷酸化位點，由此可以敲定，MyoD 蛋白在肌肉與骨骼生長發(fā)育中所起作用在一定程度上與這些磷酸化位點有著緊密聯(lián)系，其亞細胞主要定位在細胞核中。

該試驗通過RT-PCR克隆了MyoD基因的編碼區(qū)，并對其進行了基礎(chǔ)的生物信息學分析，為以后對該基因的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究奠定了一定基礎(chǔ)，以期能夠為改良暗紋東方鲀的肉質(zhì)作出貢獻。

參考文獻

[1]

SABOURIN L A，RUDNICKI M A.The molecular regulation of myogenesis[J].Clinical cenetics，2000，57（1）：16-25.

[2]ALVES H J，ALVARES L E，GABRIEL J E，et al.Influence of the neural tube/notochord complex on MyoD expression and cellular proliferation in chicken embryos[J].Brazilian journal of medical & biological research，2003，36（2）：191-197.

[3]ZOU G W，ZHU Y Y，LIANG H W，et al.Association of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and myogenic factor 6 genes with growth traits in Nile tilapia （Oreochromis niloticus）[J].Aquaculture international，

2015，23（5）：1217-1225.

[4]ZHONG X，WANG Q Q，LI J W，et al.Ten-eleven translocation-2 （Tet2） is involved in myogenic differentiation of skeletal myoblast cells in vitro[J].Scintific reports，2017，7：1-11.

[5]于凌云，白俊杰，葉星，等.大口黑鱸MyoD cDNA的克隆和序列分析[J].生物技術(shù)通報，2008（S1）：301-306.

[6]項露頡，孫麗敏，姜懷志.生肌決定因子（MyoD）基因家族調(diào)控動物生產(chǎn)性能發(fā)揮的研究概述[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2016（2）：54-58.

[7]王立新.草魚MyoD基因cDNA克隆和表達研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2005.

[8]AKIZAWA Y，KANNO H，KAWAMICHI Y，et al.Enhanced expression of myogenic differentiation factors and skeletal muscle proteins in human amnion-derived cells via the forced expression of MYOD1[J].Brain & development，2013，35（4）：349-355.

[9]BLUM R，DYNLACHT B D.The role of MyoD1 and histone modifications in the activation of muscle enhancers[J].Epigenetics，2013，8（8）：778-784.

[10]LIU C，MCFARLAND D C，VELLEMAN S G.Effect of genetic selection on MyoD and myogenin expression in turkeys with different growth rates[J].Poultry science，2005，84（3）：376-384.

[11]AVEROUS J，GABILLARD J C，SEILIEZ I，et al.Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation[J].Experimental cell research，2012，318（3）：217-227.

[12]成嘉，褚武英，張建社.魚類肌肉組織發(fā)生和分化相關(guān)基因的研究進展[J].生命科學研究，2010，14（4）：355-362.

[13]盧中華，俞菊華，李紅霞，等.奧利亞羅非魚、尼羅羅非魚MyoD1和MyoD2基因特征及差異[J].中國水產(chǎn)科學，2010，17（5）：903-912.

[14]蔣天明，羅興春，吳江.暗紋東方鲀養(yǎng)殖技術(shù)[J].淡水漁業(yè)，2001，31（4）：14-17.

[15]馬愛軍，陸麗君，陳超，等.東方鲀屬主要經(jīng)濟魚種繁育養(yǎng)殖、育種和基因研究現(xiàn)狀[C]//第三屆全國現(xiàn)代生態(tài)漁業(yè)管理與技術(shù)研究.北京：中國水利技術(shù)信息中心，2011.

[16]廖章斌，徐后國，衛(wèi)育良，等.河鲀營養(yǎng)研究進展及展望[J].動物營養(yǎng)學報，2018，30（4）：1286-1296.

[17]KABLAR B，KRASTEL K，TAJBAKHSH S，et al.Myf5 and MyoD activation define independent myogenic compartments during embryonic development[J].Developmental biology，2003，258（2）：307-318.

[18]DAVIS R L，WEINTRAUB H，LASSAR A B.Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts[J].Cell，1987，51（6）：987-1000.

[19]STUHLMILLER T J，GARCA-CASTRO M I.Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction[J].Cellular and molecular life sciences，2012，69（22）：3715-3737.

[20]劉宏祥，徐文娟，宋衛(wèi)濤，等.高郵鴨群體 MSTN、MyoD1和 MyoG 基因外顯子中SNP位點的分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2015，31（3）：604-612.

[21]王立新，白俊杰，葉星，等.草魚My5oD cDNA的克隆和序列分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2005，38（10）：2134-2138.

[22]GALLOWAY T F，BARDAL T，KVAM S N，et al.Somite formation and expression of MyoD，myogenin and myosin in Atlantic halibut （Hippoglossus hippoglossus L.） embryos incubated at different temperatures：Transient asymmetric expression of MyoD[J].Journal of experimental biology，2006，209（13）：2432-2441.

[23]FERNANDES J M O，KINGHORN J R，JOHNSTON I A.Differential regulation of multiple alternatively spliced transcripts of MyoD[J].Gene，2007，391（1/2）：178-185.

[24]ANDERSEN ?，DAHLE S W，VAN NES S，et al.Differential spatio-temporal expression and functional diversification of the myogenic regulatory factors MyoD1 and MyoD2 in Atlantic halibut （Hippoglossus hippoglossus）[J].Comparative biochemistry & physiology part B：Biochemistry & molecular biology，2009，154（1）：93-101.