蘇 倩，翟 帥，孫 柯，林 洋，王騰宇，呼和巴特爾，王文龍

(內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，農業(yè)農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018)

捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)屬于毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)。寄生于反芻動物消化道的圓線蟲大多數為毛圓科，而捻轉血矛線蟲是其中致病力最強的一種[1]。捻轉血矛線蟲主要以吸食宿主血液為生，導致宿主貧血、消瘦、皺胃黏膜損傷等[2]，嚴重者可導致宿主，尤其是幼齡宿主死亡。目前捻轉血矛線蟲病呈世界性分布，尤其是熱帶、亞熱帶及降雨量較多地區(qū)[3]。對于該病的治療，目前主要依賴于阿苯達唑、伊維菌素、左旋咪唑等驅蟲藥物[4]。而阿苯達唑作為一種廣譜、高效、低毒的苯并咪唑類抗蠕蟲藥物，在國內外均得到了廣泛的應用[5]。但因為多年的藥物使用不當導致這些寄生性線蟲產生耐藥性，即便是英國、荷蘭、西班牙、瑞士、德國、波蘭、意大利、法國、丹麥、瑞典和挪威等[6]一些歐洲國家也深受其害，這在一定程度上給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重威脅，導致巨大的經濟損失。根據國內外報道發(fā)現，阿苯達唑產生耐藥性的主要原因是捻轉血矛線蟲的Ⅰ型β微管蛋白(isotype-Ⅰ β-tubulin gene)基因的3個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(F167Y，E198A和 F200Y)[7-9]，即167位點由苯丙氨酸突變?yōu)榻j氨酸(TTC-TAC)，198位點由谷氨酸突變?yōu)楸彼?GAA-GCA)，200位點由苯丙氨酸突變?yōu)榻j氨酸(TTC-TAC)。眾所周知，內蒙古自治區(qū)是中國最大的草原牧區(qū)和重要的畜牧業(yè)生產基地，掌握內蒙古地區(qū)捻轉血矛線蟲阿苯達唑耐藥情況，對捻轉血矛線蟲病的防控來說至關重要，因此，本實驗室一直在內蒙古地區(qū)展開捻轉血矛線蟲耐藥性調查[10]，本試驗選取耐藥蟲株，對其種群阿苯達唑耐藥性Ⅰ型β-tubulin基因進行單核苷酸多態(tài)性調查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品蟲株 捻轉血矛線蟲蟲株采自于內蒙古鄂爾多斯市烏審旗、烏蘭察布市察右后旗和興安盟科右前旗，根據雌蟲和雄蟲的形態(tài)特征，體視顯微鏡下鑒定后分裝到凍存管中，標記好后存入液氮中。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，天根生化科技公司產品；PCR擴增用試劑，TaKaRa公司產品；DNA Marker，北京全式金生物技術有限公司產品；瓊脂糖，BIOWEST公司產品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(PowerCycler384)、水平凝膠電泳儀(BG-subMIDI)，北京百晶生物技術公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據楊新[11]的方法，由北京六合華大基因科技有限公司分別合成針對捻轉血矛線蟲核糖體第二內轉錄間隔基因(ITS-2)序列和Ⅰ型β-tubulin基因序列的特異性引物，上、下游引物序列見表1。

表1 ITS-2和Ⅰ型β-tubulin基因引物序列

1.2.2 蟲體基因組DNA提取 分別取鄂爾多斯市烏審旗、烏蘭察布市察右后旗和興安盟科右前旗3個地區(qū)各19條捻轉血矛線蟲雄蟲，按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取DNA。

1.2.3 捻轉血矛線蟲ITS-2基因擴增鑒定 PCR擴增反應體系為25 μL：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaqTM12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；然后94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸 30 s，共 35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。將PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 捻轉血矛線蟲Ⅰ型β-tubulin基因擴增 PCR擴增反應體系為25 μL：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaqTM12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；然后94℃變性40 s，53℃退火40 s，68℃延伸 40 s，共40個循環(huán)；最后68℃延伸7 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.5 測序分析 將捻轉血矛線蟲Ⅰ型β-tubulin基因擴增產物送北京六合華大基因科技有限公司進行雙向測序，分析測序結果。

2 結果

2.1 捻轉血矛線蟲ITS-2基因擴增

PCR擴增后，3個地區(qū)蟲樣電泳結果顯示(圖1)，擴增出大小約265 bp的條帶，與ITS-2基因預期大小一致，證明這3個地區(qū)各自的19條雄蟲樣品均為捻轉血矛線蟲，可以用作后續(xù)試驗使用。

M.DNA標準DL 2 000；1～19.樣品ITS-2基因PCR產物；20.陽性對照；21.陰性對照

2.2 捻轉血矛線蟲Ⅰ型β-tubulin基因擴增

PCR擴增后，電泳結果顯示(圖2)，3個地區(qū)57條捻轉血矛線蟲雄蟲DNA樣本均擴增出大小約385 bp的條帶，與Ⅰ型β-tubulin基因基因預期大小一致，擴增產物可以用于后續(xù)測序分析。

M.DNA標準DL 2 000；1～19.樣品Ⅰ型β-tubulin基因PCR產物；20.陽性對照；21.陰性對照

2.3 測序結果分析

對內蒙古3個地區(qū)57條捻轉血矛線蟲雄蟲Ⅰ型β-tubulin基因PCR產物進行測序，經Chromas軟件統(tǒng)計分析基因序列峰圖后，顯示內蒙古3個地區(qū)57條捻轉血矛線蟲雄蟲Ⅰ型β-tubulin基因167位點均未發(fā)生突變，全部為純合敏感型。而198位點，烏審旗有1條(5.26%)為純合耐藥型，2條(10.53%)為雜合耐藥型，16條(84.21%)為純合耐藥型；200位點，烏審旗有16條(84.21%)為純合敏感型，2條(10.53%)為雜合耐藥型，1條(5.26%)為純合耐藥型，見表2。察右后旗198位點有8條(42.10%)為純合敏感型，5條(26.32%)為雜合耐藥型，6條(31.58%)為純合耐藥型；200位點有6條(31.58%)為純合敏感型，11條(57.89%)為雜合耐藥型，2條(10.53%)為純合耐藥型，見表3?？朴仪捌煊?98位點有1條(5.26%)為純合敏感型，18條(94.74%)為純合耐藥型；200位點有18條(94.74%)為純合敏感型，1條(5.26%)為雜合耐藥型，見表4。綜合分析這3個地區(qū)捻轉血矛線蟲雄蟲Ⅰ型β-tubulin基因序列發(fā)現有4種基因型，分別是198純合耐藥型及200純合敏感型：烏審旗16條84.21%，察右后旗6條31.58%，科右前旗18條94.74%。198純合敏感型及200純合耐藥型：烏審旗1條5.26%，察右后旗2條10.53%。198純合敏感型及200雜合耐藥型：察右后旗6條31.58%，科右前旗1條5.26%。198及200均雜合耐藥型：烏審旗2條10.53%，察右后旗5條26.32%，見表5。

表2 內蒙古鄂爾多斯市烏審旗Ⅰ型β-tubulin基因3個位點單核苷酸多態(tài)性

表3 內蒙古烏蘭察布市察右后旗Ⅰ型β-tubulin基因3個位點單核苷酸多態(tài)性

表4 內蒙古興安盟科右前旗Ⅰ型β-tubulin基因3個位點單核苷酸多態(tài)性

表5 內蒙古地區(qū)捻轉血矛線蟲Ⅰ型β-tubulin基因的基因型及其頻率

3 討論

阿苯達唑在1976年被美國SmithKline & Beecham公司研制開發(fā)，1977年首次應用，中國獸藥監(jiān)察所在1979年開發(fā)成功，1981年試生產后，到現在這幾十年來，廣泛應用于國內畜禽蠕蟲病臨床防治，在一定程度上促進了我國畜牧行業(yè)的發(fā)展[5]。但根據國外Kotze等對某一類藥物產生耐藥性的物種首次被報道時間的統(tǒng)計與藥物研發(fā)時間對比發(fā)現，在大多數情況下，耐藥性是在每個藥物組引入后的10年內出現的[13]。所以目前國內外捻轉血矛線蟲耐藥性的問題日趨嚴重。

本試驗對內蒙古烏審旗、察右后旗和科右前旗3個地區(qū)捻轉血矛線蟲阿苯達唑耐藥種群Ⅰ型β-tubulin基因3個單核苷酸多態(tài)性位點進行了調查，結果發(fā)現3個地區(qū)167位點均未發(fā)生突變，這也與國內其他地區(qū)的調查結果相一致[14-15]，而198和200位點則有突變，總體上看198位點突變頻率高于200位點。但據國外報道，檢測到167、200位點突變頻率高，198位點未發(fā)生突變[16]。這說明地區(qū)不同，3個位點發(fā)生突變的頻率也不相同。分析這57條雄蟲基因序列發(fā)現4種基因型，分別是198純合耐藥型及200純合敏感型、198純合敏感型及200純合耐藥型、198純合敏感型及200雜合耐藥型和198及200均雜合耐藥型。Barrere等報道當10%的個體具有抗性基因型(TAC/TAC200、TAC/TAC167或TTC/TAC167、TAC/TTC200)時，一個種群被認為是耐藥的。但由于文獻中沒有描述耐藥的閾值，所以10%的閾值是任意選擇的。當在一個特定農場估計的耐藥捻轉血矛線蟲的比例超過這一閾值時，假定該特定農場的捻轉血矛線蟲為阿苯達唑耐藥型[9]。耐藥基因型頻率烏審旗為100%，察右后旗68.42%，科右前旗94.74%，這已經大大地超過了10%，表明這3個地區(qū)捻轉血矛線蟲對阿苯達唑耐藥性嚴重。額葉勒德格在2018年通過對烏審旗地區(qū)綿羊主要蠕蟲病流行病學及驅蟲效果調查研究，表明該地區(qū)捻轉血矛線蟲感染率較高，且為優(yōu)勢蟲種，對丙硫咪唑產生了嚴重的耐藥性[17]。趙學亮等[18]2018年通過糞便蟲卵減少試驗對烏蘭察布市察右后旗羊場調查發(fā)現，也存在耐藥性，這表明與國際公認的糞便蟲卵減少試驗(FECRT)結果一致，說明Ⅰ型β-tubulin基因3個位點單核苷酸多態(tài)性檢測方法可靠。Barrere等也認為這是一個檢測苯并咪唑類耐藥性比較有效的方法，而且可以在捻轉血矛線蟲低感染量時檢測出其耐藥情況，以便提前隔離治療。本研究結果為捻轉血矛線蟲病的預防和治療提供了新思路，可有效避免或減緩捻轉血矛線蟲耐藥性的產生，進一步推動養(yǎng)羊產業(yè)疾病防控的發(fā)展，為養(yǎng)殖戶減少一定的經濟損失。