周欽育，黃燕燕，趙 珊，黃泳堯，林鐘培，劉冬梅

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州510640）

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）又被稱為胞壁質(zhì)酶（Muramidase）、N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase）[1]，可以選擇性地水解細(xì)菌細(xì)胞壁上肽聚糖的β-1，4 糖苷鍵，使得細(xì)胞在溶解死亡的同時(shí)，不破壞其它組織[2]，是一種天然、安全性能良好的殺菌劑和防腐劑，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用[3]，可廣泛應(yīng)用于食品生物防腐、醫(yī)藥、日用化工等行業(yè)[4-6]。目前研究表明，雞蛋蛋清是溶菌酶生產(chǎn)的主要原料，其溶菌酶的含量可達(dá)到0.2%～0.4%[7]，然而，蛋清中含有多種蛋白質(zhì)，需對蛋清中的溶菌酶進(jìn)行分離提純。

目前，常用的溶菌酶提純方法包括結(jié)晶法、親和膜色譜法、離子交換法、超濾法等[8-10]。Curcio 等[11]采用靜態(tài)膜結(jié)晶法以NaCl 為沉淀劑，MgCl2溶液為洗脫液，醋酸鈉溶液為緩沖液調(diào)節(jié)蛋清液pH值，靜置1 d 后溶菌酶以晶體形式析出，其操作簡單，然而生產(chǎn)周期長，原料利用率低，且制得的溶菌酶純度較低。Ho[12]用活性紅120 對磁性殼聚糖微球表面進(jìn)行改性，并采用磷酸鹽緩沖液作為洗脫液，制得的溶菌酶解吸率為92.6%，回收率為89.1%，其制得的溶菌酶純度高，然而操作難度較大，成本高，難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。離子交換法可利用離子交換劑與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力不同起到分離效果[13]。余海芬等[14]采用陽離子交換樹脂法，以硫酸銨為洗脫液提取蛋清溶菌酶，制得溶菌酶比酶活達(dá)9 500 U/mg，其操作簡單，生產(chǎn)周期短，效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。超濾法以超濾膜兩端壓力差為動(dòng)力，通過控制膜孔徑大小進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離[15]。Mayani 等[16]用超濾法所制得的蛋清溶菌酶純品純度達(dá)96%，回收率為75%，其操作簡單、快速，相較其它方法條件溫和，是生物工業(yè)領(lǐng)域中較有潛能的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。綜上，現(xiàn)有的溶菌酶提取方法均存在一定的缺陷，因此，本研究協(xié)同使用離子交換法、超濾法[17]，研究一種新型、高效的提純?nèi)芫傅姆椒?，即選用724 陽離子交換樹脂對溶菌酶進(jìn)行特異性吸附，洗脫后經(jīng)二步超濾獲得精制溶菌酶，經(jīng)單因素試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化提純工藝參數(shù)，并對提純后的溶菌酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步表征。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮雞蛋，市售；溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品，南京建成生物有限公司；溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus Fleming，保藏編號：GIM1.132），廣東省微生物保藏中心；724 大孔弱酸性陽離子交換樹脂，鄭州勤實(shí)科技有限公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，南京建成生物有限公司；其它試劑均為分析純級試劑。

pH 計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；可見-紫外分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；YXQ-LS-18SI 立式壓力蒸汽滅菌器、SW-GJ-1R超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；GXZ-300D 生化培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；DHG-9194A 電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取溶菌酶的工藝流程 蛋清攪拌、過濾→樹脂預(yù)處理 （724 大孔弱酸性陽離子交換樹脂提取蛋清液中的溶菌酶[18]，鹽酸、氫氧化鈉溶液的濃度為1 mol/L，浸泡時(shí)間均為10 h）→吸附→洗脫→超濾技術(shù)輔助提純、脫鹽→冷凍干燥得溶菌酶純品。

1.2.2 工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗(yàn) 以樹脂用量、蛋清濾液pH值、洗脫液濃度、洗脫時(shí)間為考察因素，測定洗脫液中溶菌酶質(zhì)量濃度（mg/mL）及比活力（U/mg），并以溶菌酶的比活力（U/mg）為指標(biāo)考察陽離子交換法的單因素試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2.2 Box-Behnken 試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇樹脂用量（A）、洗脫液NaCl 濃度（B）、蛋清濾液pH 值（C）、洗脫時(shí)間（D）4 個(gè)因素，每個(gè)因素選取低、中、高3 個(gè)水平（表1），采用4 因素3水平的響應(yīng)曲面方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并以溶菌酶比活力為指標(biāo)，確定最佳提取工藝。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Box-Behnken experimental factor level table

1.2.2.3 超濾試驗(yàn) 將陽離子交換法所得到比活力最高的洗脫液，置于不同轉(zhuǎn)速、時(shí)間下進(jìn)行離心超濾（截留分子質(zhì)量為50 ku），棄上層液，所得下層液于6 500×g，20 min 離心進(jìn)行二步超濾（3 ku），留上層濃縮液，并以酶含量、比活力為考察指標(biāo)，探究最優(yōu)超濾條件。

1.2.3 溶菌酶含量及比活力測定方法

1.2.3.1 溶菌酶含量的測定 參考《雞蛋蛋清中溶菌酶的測定 分光光度法》（GB/T 25879-2010）[19]，略有改動(dòng)。以0.9%NaCl 溶液為參比液，在波長281 nm 處依次測定各溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取試樣1 mL，用0.9%NaCl 溶液稀釋定容至25 mL，混勻，在波長281 nm 處測定試樣溶液的吸光度，平行測定3 次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算試樣的溶菌酶濃度。

1.2.3.2 溶菌酶比活力的測定 參照《溶菌酶活性檢測方法》（GB/T 30990-2014）[20]，略有改動(dòng)。于待測管中加入0.4 mL 待測酶液，再加入2 mL 溶壁微球菌菌液后開始計(jì)時(shí)，在波長450 nm 處分別反應(yīng)15 s 和75 s 后，記錄吸光度A15和A75。按每分鐘較OD450值下降0.001 為1 個(gè)活力單位（U）定義，計(jì)算酶活力，見式（1）。

式中，EA——溶菌酶比活力（U/mg）；Ew——所測酶液中溶菌酶含量（mg）。

1.2.4 溶菌酶相對酶活的測定 測定溶菌酶在不同條件下的酶活，計(jì)酶活最高值為100%，相對酶活為在不同條件下酶活與最高酶活的百分比。

1.2.5 溶菌酶產(chǎn)品純度鑒定 參照Laemmli 等[21]的聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）檢測1.2.1節(jié)中吸附溶菌酶的洗脫液和超濾酶液的純度。電泳結(jié)束后，使用凝膠成像儀采集圖像，Image Lab 5.2.1 軟件分析圖像。

1.2.6 蛋清溶菌酶部分酶學(xué)性質(zhì)的探究 以1.2.1 節(jié)中經(jīng)過優(yōu)化后制得的溶菌酶為樣品酶，探究pH 值、溫度、金屬離子、表面活性劑對溶菌酶酶活的影響，以及該酶的溫度和pH 穩(wěn)定性。

1.2.6.1 pH 值對溶菌酶酶活的影響 使用不同pH 值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為20 g/mL 的酶液，25 ℃水浴30 min 后，按1.2.4 節(jié)所述方法測定相對酶活（%）。

1.2.6.2 溫度對溶菌酶酶活的影響 使用pH 值為7.0 的生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為20 g/mL 的酶液，水浴加熱至不同溫度（20，30，40，50，60，70，80 ℃），保溫30 min 后，測定相對酶活（%）。

1.2.6.3 溶菌酶的pH 穩(wěn)定性 使用不同pH 值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的酶液，并分別反應(yīng)30，60，90 min 后，測定相對酶活（%）。

1.2.6.4 溶菌酶的溫度穩(wěn)定性 使用pH 值為7.0的生理鹽水，配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的酶液，水浴加熱至不同溫度（30，40，50，60，70，80℃），保溫30，60，90 min 后，測定相對酶活（%）。

1.2.6.5 金屬離子對溶菌酶酶活的影響 用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的酶液，加入等體積的不同金屬離子（Na+，K+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，Mg2+）溶液，使溶液中最終金屬離子含量為0.01 mol/L，同時(shí)設(shè)空白對照，25 ℃水浴30 min 后，測定相對酶活（%）。

1.2.6.6 表面活性劑對溶菌酶酶活的影響 使用pH 值為7.0 的生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的酶液，等體積加入體積分?jǐn)?shù)10%的甘油、Tween20、Tween40、Tween80，設(shè)空白對照，25 ℃水浴30 min 后，測定相對酶活（%）。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert 8.0.6 軟件響應(yīng)面設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、回歸模型建立，采用Origin Pro 8.0 做圖；試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽離子交換法單因素優(yōu)化

2.1.1 樹脂用量優(yōu)化 由圖1可知，當(dāng)?shù)扒鍢渲葹?0∶2 時(shí)，溶菌酶比活力達(dá)到最大值14 997.78 U/mg，之后隨著樹脂含量的增加，溶菌酶比活力緩慢下降。而酶含量隨蛋清樹脂比的增加而增加，在蛋清樹脂比到達(dá)10∶2.5 之后，增加緩慢。由此可知，當(dāng)?shù)扒鍢渲葹?0∶2.5 時(shí)，所得溶菌酶的比活力較高，樹脂用量合適，適宜提取分離溶菌酶。

2.1.2 蛋清濾液pH 值優(yōu)化 由圖2可知，當(dāng)?shù)扒鍨V液pH 值為9 時(shí)，溶菌酶比活力最高（16 048.71 U/mg），當(dāng)pH 值過高或過低時(shí)，酶的比活力都會(huì)有所降低，可能由于pH 值改變了蛋清濾液中酶的帶電狀態(tài)，過酸、過堿都會(huì)對酶結(jié)構(gòu)造成不可逆的破壞，使酶的比活力下降[22]。與酶含量達(dá)到最高點(diǎn)相比（pH 8），pH 9 時(shí)酶含量下降，而比活力卻升高，即陽離子交換法提純蛋清溶菌酶的選擇pH值為9 做后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同蛋清樹脂比對溶菌酶比活力的影響Fig.1 The effect of different proportions of egg white resin on lysozyme activity

圖2 不同蛋清濾液pH 值對溶菌酶比活力的影響Fig.2 The effect of different pH values of egg white filtrate on lysozyme activity

2.1.3 NaCl 溶液（洗脫液）濃度優(yōu)化 由圖3可知，隨NaCl 濃度的升高，溶菌酶的比活力先上升后下降，當(dāng)NaCl 濃度為1 moL/L 時(shí)，所得溶菌酶的比活力最高，此時(shí)的洗脫液濃度適宜提取分離溶菌酶。當(dāng)NaCl 濃度高于1 moL/L 時(shí)，酶的比活力反而下降，酶含量變化卻不大，可能由于溶菌酶在高濃度鹽溶液中發(fā)生鹽析作用導(dǎo)致[23]。

2.1.4 洗脫時(shí)間優(yōu)化 由圖4可知，當(dāng)洗脫時(shí)間為60 min 時(shí)，所得溶菌酶的比活力最高，隨著洗脫時(shí)間繼續(xù)延長，酶含量增加緩慢，酶比活力反而下降，綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本，選定洗脫時(shí)間為60 min。

2.2 陽離子交換法條件優(yōu)化

綜上，由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，陽離子交換法最優(yōu)工藝條件為：蛋清濾液樹脂比為10∶2.5，pH 9.0，NaCl （洗脫液） 濃度1 mol/L，洗脫時(shí)間60 min。由此，進(jìn)一步做Box-Behnken 試驗(yàn)優(yōu)化陽離子交換法條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

圖3 不同NaCl 濃度對溶菌酶比活力的影響Fig.3 The effect of different NaCl concentrations on lysozyme activity

圖4 不同洗脫時(shí)間對溶菌酶比活力的影響Fig.4 The effect of different elution time on lysozyme activity

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-behnken experiment results

采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析，如表3所示。由表3可知，擬合模型的P=0.0014＜0.05，說明模型與實(shí)際情況擬合良好。根據(jù)以上分析得知溶菌酶比活力R1對自變量每100 mL 蛋清濾液中樹脂用量（A）、NaCl 濃度（B）、蛋清濾液pH值（C）、洗脫時(shí)間（D）的多元回歸方程為：

R1=20 866.66-1 432.26A+194.18B+486.75C+539.58D-961.62AB-1 252.19AC-2 929.88AD-21.46BC-2 724.86BD+90.11CD-6 079.24A2-5 995.65B2-3 410.58C2-3 903.162。

由方程可知，溶菌酶比活力和4 個(gè)自變量之間具有顯著線性關(guān)系?；貧w方程的二次項(xiàng)系數(shù)比較大，交互項(xiàng)系數(shù)中AD、BD 的交互系數(shù)很大，說明樹脂用量和洗脫時(shí)間、NaCl 濃度和洗脫時(shí)間之間的交互效應(yīng)很大，AB、AC 的交互系數(shù)較大，說明樹脂用量和NaCl 濃度之間、樹脂用量和pH 值之間交互效應(yīng)較大，而BC、CD 的交互系數(shù)比較小，說明NaCl 濃度和pH 值之間、pH 值和洗脫時(shí)間之間的交互效應(yīng)小。

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對測定的溶菌酶的比活力的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，并對各因子的偏回歸系數(shù)進(jìn)行檢測。一次項(xiàng)中A 的回歸系數(shù)較顯著，P=0.0806，說明蛋清樹脂比對提取的溶菌酶比活力有較顯著作用。二次項(xiàng)中A、B、C、D 的偏回歸系數(shù)均達(dá)到極顯著水平。交互項(xiàng)AD、BD 回歸系數(shù)較其它因素顯著，說明樹脂用量和洗脫時(shí)間、NaCl 濃度和洗脫時(shí)間之間的交互項(xiàng)對溶菌酶比活力影響較為顯著。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)分析Table 3 Box-behnken experiment analysis

為了得到最高的溶菌酶比活力，吸附和洗脫的各條件需要合適的交叉選擇。響應(yīng)面圖可直觀反映各因素及交互作用對酶活力的影響[24-26]，故取3 項(xiàng)顯著性較高的交互項(xiàng)制作響應(yīng)面圖，根據(jù)圖5～7 的Box-Behnken 優(yōu)化試驗(yàn)擬合響應(yīng)曲面圖和方差分析得知，對溶菌酶比活力影響大小順序?yàn)锳D>BD>AC。

對二次回歸方程求一階偏導(dǎo)，當(dāng)響應(yīng)值R1（溶菌酶比活力） 為最大值時(shí)，各因子水平為每100 mL 蛋清濾液中，樹脂用量（A）為24.20 mL、NaCl濃度（B）為1.00 mol/L、蛋清濾液pH 值（C）為9.10、洗脫時(shí)間（D）為62.61 min。此時(shí)理論預(yù)測溶菌酶比活力為21 041.1 U/mg。

對所獲得的陽離子交換法各最優(yōu)條件做平行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)5 次，如表4所示，得到的溶菌酶比活力為20 509.58 U/mg，與理論值接近。

2.3 超濾提純條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

圖5 樹脂用量和洗脫時(shí)間的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of resin dosage and elution time

圖6 洗脫液濃度和洗脫時(shí)間的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of elution concentration and elution time

圖7 樹脂用量和pH 值的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of resin dosage and pH value

表4 最優(yōu)條件下溶菌酶比活力測定結(jié)果Table 4 The results of lysozyme activity in the optimal condition

將上述優(yōu)化條件制得酶液做進(jìn)一步超濾提純優(yōu)化，將酶液置于截留量為50 ku 的超濾離心管中，于4 000～6 000×g，離心5～15 min，除去雜蛋白，棄去離心管上層液。再將下層液置于截留量為3 ku 的超濾離心管中，于6 500×g，離心20 min，保留上層截留液，測定其酶含量及比活力，結(jié)果如表5所示?？芍?，隨著轉(zhuǎn)速的升高，酶含量逐漸升高，而溶菌酶比活力呈先上升后下降的趨勢，推測由于離心轉(zhuǎn)速過低使得溶菌酶被部分截留在上層，而離心轉(zhuǎn)速過高，雖能將溶菌酶全部透過下層，但部分雜蛋白不能有效去除，同樣不被截留，或是溶菌酶在高速離心過程中有所損傷，致酶活力下降。且隨著離心時(shí)間延長，比活力有所增加，然而離心時(shí)間不適宜過長，過長的離心時(shí)間會(huì)使效率降低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。故當(dāng)溶菌酶比活力為最大值時(shí)，選擇50 ku 超濾離心管，在5 000×g條件下離心10 min。

2.4 溶菌酶純度檢驗(yàn)

將最優(yōu)陽離子交換法所得的洗脫液與最優(yōu)的超濾液分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳試驗(yàn)，電泳結(jié)果如圖8和圖9所示。

由圖8、圖9對比可知，洗脫液和超濾液均可在14.4 ku 看見明顯條帶，與蛋清溶菌酶的相對分子質(zhì)量相符[27-28]。此外，只經(jīng)過陽離子交換法的洗脫液的雜蛋白及雜質(zhì)鹽較多，影響純度，而洗脫液經(jīng)過二步超濾后，雜蛋白、雜質(zhì)鹽較少，提取的溶菌酶純度較高。

選用經(jīng)過陽離子交換法協(xié)同二步超濾法提純的蛋清溶菌酶液，測定溶菌酶的純度，結(jié)果如圖10所示，并用Image Lab 5.2.1 軟件對圖像進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)如表6所示。

表5 洗脫液離心試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of eluent centrifugal experiment

圖8 洗脫液的SDS-PAGE 凝膠電泳圖Fig.8 SDS-PAGE gel electrophoresis diagram of eluent

圖9 超濾液的SDS-PAGE 凝膠電泳圖Fig.9 SDS-PAGE gel electrophoresis diagram of ultrafiltrate

圖10 超濾液的凝膠成像圖Fig.10 Gel imaging of ultrafiltrate

表6 凝膠成像數(shù)據(jù)分析結(jié)果Table 6 Gel imaging data analysis results

由表6可知，超濾液中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在14.4～15.1 ku，符合蛋清溶菌酶分子質(zhì)量的分布范圍[26-27]。除泳道4 外，其余泳道平均值為2 290 619，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的第6 條帶（溶菌酶條帶）含量為0.125 μg/μL，上樣量為5 μL，相對濃度值為619 080，試驗(yàn)測得超濾液中蛋白質(zhì)含量為2.40 μg/μL，上樣量10 μL（上樣緩沖液∶樣品（體積比）=4∶1），相對濃度值為2 290 619，故估算得溶菌酶純度為96.36%，測得該溶菌酶的比活力為23 718.61 U/mg。

2.5 溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)探究

2.5.1 pH 值對溶菌酶酶活的影響 由圖11可知，隨pH 值的不斷升高，溶菌酶的相對酶活呈先上升后下降的趨勢，溶菌酶在pH 5～8 均可保持85%以上的相對酶活，在pH 值為3～4 時(shí)仍有70%以上的相對酶活，在pH 值為7.0 時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，可推測，溶菌酶的最適pH 值約為7.0。pH值影響溶菌酶酶活的原因可能是由于pH 值的改變對底物溶壁微球菌的狀態(tài)產(chǎn)生影響[29]，也可能是pH 值使得酶的帶電狀態(tài)改變，從而影響酶的活性[30]。

2.5.2 溫度對溶菌酶酶活的影響 由圖12可知，在20～60 ℃時(shí)，溶菌酶相對酶活隨溫度升高緩慢上升，且相對酶活均在78%以上，溫度作用范圍廣；在60 ℃時(shí)，酶活達(dá)到最高值，若繼續(xù)升溫，則酶活下降較快。其可能是因?yàn)榈蜏貢r(shí)隨溫度上升分子運(yùn)動(dòng)加快，提高了反應(yīng)速度，而當(dāng)溫度到達(dá)60 ℃后，隨反應(yīng)溫度的升高，蛋清溶菌酶逐漸失活，使得酶活性下降[31]。

圖11 pH 值對溶菌酶活性的影響Fig.11 Effect of pH value on lysozyme activity

圖12 溫度對溶菌酶活性的影響Fig.12 Effect of temperature on lysozyme activity

2.5.3 溶菌酶的pH 穩(wěn)定性 由圖13可知，溶菌酶在偏酸及中性的環(huán)境下比較穩(wěn)定，在pH 4.0～7.0 的范圍內(nèi)，相對酶活保持在88%以上。而在堿性環(huán)境下，隨著時(shí)間延長，相對酶活逐漸下降，且隨pH 值升高，變化幅度越來越大，在pH 8.0 的生理鹽水中處理90 min，酶活力降為初始的80%，而在pH 9.0 的生理鹽水中處理90 min，酶活力降為初始的65%。故溶菌酶在偏酸性及中性條件下較為穩(wěn)定，而過酸、過堿易使其失活，這與傅婷等[22]的研究結(jié)果類似，可能是由于溶菌酶在酸性環(huán)境中其主鏈構(gòu)象隨酸度變化影響不大，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定[32]。

2.5.4 溶菌酶的溫度穩(wěn)定性 由圖14可知，在30～60 ℃時(shí)，溫度對酶活影響不大，溶菌酶保持較高穩(wěn)定性；在70 ℃保溫一段時(shí)間，酶活緩慢下降，90 min 后，比活力降低為初始值的78%；而在80℃保溫一段時(shí)間，酶活下降速率較高，90 min 后，比活力降為初始值的52%?？赡苁请S溫度升高，溶菌酶變性失活程度升高，失活速度加快。

2.5.5 金屬離子對溶菌酶酶活的影響 由圖15可知，Na+、Ca2+對溶菌酶有較強(qiáng)的激活作用；K+對溶菌酶激活作用較弱；而Zn2+對溶菌酶活性有較強(qiáng)的抑制作用；其它金屬離子（Mg2+、Mn2+）對溶菌酶活性無明顯影響。故除少數(shù)離子對溶菌酶活性有抑制作用外，大部分金屬離子對酶活不會(huì)產(chǎn)生影響或起到激活作用，即大部分金屬離子與溶菌酶具有良好的配伍作用[33]。

2.5.6 表面活性劑對溶菌酶酶活的影響 由圖16可知，幾種表面活性劑對蛋清溶菌酶活性都有一定的抑制作用，其中Tween20、Tween40、Tween80 對酶活力影響較小，相對酶活力保持在84%以上，而經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)10%的甘油處理的溶菌酶相對酶活力降至78%。這可能與表面活性劑對溶菌酶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響有關(guān)；表面活性劑的高黏度特性會(huì)降低溶菌酶的活性[34]，因而在溶菌酶制備過程中應(yīng)減少或不使用表面活性劑。

圖13 溶菌酶的pH 穩(wěn)定性Fig.13 The pH stability of lysozyme

圖14 溶菌酶的溫度穩(wěn)定性Fig.14 Temperature stability of lysozyme

圖15 0.01 mol/L 金屬離子對溶菌酶活性的影響Fig.15 Effect of metal ions （c=0.01 mol/L）on lysozyme activity

3 結(jié)論

圖16 0.1 mg/mL 表面活性劑對溶菌酶活性的影響Fig.16 Effect of surfactant （c=0.1 mg/mL）on lysozyme activity

本文對陽離子交換法協(xié)同超濾技術(shù)提取蛋清中溶菌酶的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對溶菌酶的純度和部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究，主要結(jié)論如下：

1）基于單因素和Box-Behnken 試驗(yàn)得到最優(yōu)提取工藝條件為：樹脂用量為蛋清濾液體積為24.2%，洗脫液為1.00 mol/L NaCl，蛋清濾液pH值為9.10，洗脫時(shí)間為62.61 min，此時(shí)理論預(yù)測酶液的比活力為21 041.1 U/mg。對所獲得的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證得到實(shí)際酶液的比活力為20 509.58 U/mg。將優(yōu)化后的酶液進(jìn)行超濾優(yōu)化，并進(jìn)行SDS-PAGE 純度鑒定，所得二步超濾條件為：使用50 ku 超濾，在5 000×g 條件下離心10 min，再用3 ku 超濾，6 000×g 離心20 min，最終測得溶菌酶的比活力為23 718.61 U/mg，純度為96.36%。

2）通過對溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究可知，溶菌酶最適pH 值為7.0，pH 值在4.0～7.0 范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；最適反應(yīng)溫度為60 ℃，低溫下熱穩(wěn)定性良好，在較高溫度下酶活下降較快；Na+、Ca2+對酶有較強(qiáng)激活作用，K+有一定激活作用，Mg2+、Mn2+對酶活影響不大，Zn2+對酶有明顯抑制作用；表面活性劑甘油、Tween20、Tween40、Tween80 均對溶菌酶有抑制作用，甘油的抑制作用較強(qiáng)。

本文通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化陽離子交換法-超濾法協(xié)同提取蛋清中溶菌酶最佳的工藝條件，并對所提取溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究，為下一步工業(yè)化及規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。