張建旭，王璐穎，鄭曉衛(wèi)，李 寧，孫紀(jì)錄*，桑亞新

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室 北京102209）

殼聚糖在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、生物醫(yī)藥等多個領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2]。幾丁質(zhì)脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA）是催化水解幾丁質(zhì)中的乙?；?，使幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化殼聚糖的一組酶[3]。酶法生產(chǎn)殼聚糖綠色環(huán)保，是該行業(yè)未來的一個重要發(fā)展方向[4]。由CDA處理幾丁質(zhì)得到的殼聚糖脫乙酰度高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定[5]。然而，CDA 直接作用于幾丁質(zhì)效率低，酶活力不高等，限制其在實際生產(chǎn)中的使用[6]。近期的研究表明，CDA 對經(jīng)處理破壞晶體型態(tài)后形成的無定形、膠體或超細(xì)幾丁質(zhì)能發(fā)揮出較大的酶活性[7-8]。目前，國內(nèi)外對CDA 的研究大都集中在高產(chǎn)菌株選育，產(chǎn)酶工藝條件優(yōu)化，酶學(xué)特性，酶的結(jié)構(gòu)以及CDA 對底物的催化機理等方面[4]，尚未有利用小龍蝦殼作為培養(yǎng)基優(yōu)化產(chǎn)酶的報道。

我國小龍蝦產(chǎn)量豐富，消費量大，副產(chǎn)物小龍蝦殼數(shù)量巨大。將小龍蝦殼回收利用，有利于資源利用和環(huán)境保護(hù)[9]。小龍蝦殼中含有豐富的蛋白質(zhì)[10-11]，可為紅球菌生長提供營養(yǎng)，然而，其與幾丁質(zhì)和碳酸鈣緊密結(jié)合[12]，不利于微生物的利用。理論上，通過一定的預(yù)處理，可使蝦殼中的蛋白質(zhì)脫落分散，從而有利于紅球菌的利用[11]。目前報道的紅球菌產(chǎn)CDA 發(fā)酵培養(yǎng)基往往成本較高[13]。本研究擬利用小龍蝦殼粉作為主要原料，通過預(yù)處理和適量補加成分，研發(fā)紅球菌高產(chǎn)CDA 的新型培養(yǎng)基，并優(yōu)化其它培養(yǎng)條件，以期降低CDA 的生產(chǎn)成本，從而降低酶法生產(chǎn)殼聚糖的成本。

1 材料與方法

1.1 菌種

紅球菌（Rhodococcus sp.）菌株11-3[14]，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院食品發(fā)酵工程重點實驗室惠贈。

1.2 主要原料、試劑和培養(yǎng)基

小龍蝦殼粉：小龍蝦，保定市農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場。清洗蝦殼，然后于電熱鼓風(fēng)干燥器中60 ℃干燥至恒重。將烘干的蝦殼粉碎，過120 目篩，制得蝦殼粉。

主要試劑：堿性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；蔗糖、硫酸銨，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；玉米漿，華北制藥康欣有限公司；對硝基苯胺，天津市華東試劑廠；對硝基乙酰苯胺，上海源葉生物有限公司；除玉米漿為生化試劑外，其它均為分析純級試劑。

培養(yǎng)基：NB 培養(yǎng)基，用于紅球菌的活化。

1.3 主要儀器與設(shè)備

721G 可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3DW 型pH 計，安徽合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；ZWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市良友儀器有限公司；SCIENTZ-48 高通量組織研磨儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種的活化 將冷藏的紅球菌11-3 接種于NB 培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min，搖床振蕩培養(yǎng)12 h。

1.4.2 幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活力測定 CDA 酶活力的測定方法參照文獻(xiàn)[15]，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 P-nitroaniline standard curve

1.4.3 蝦殼粉培養(yǎng)基的配制 經(jīng)預(yù)試驗，將10%的蝦殼粉配制成培養(yǎng)基，調(diào)pH 值至7.5，分裝至三角瓶中，滅菌后以1%接種量接入活化的紅球菌11-3，于180 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)2 d，以發(fā)酵液為粗酶液測定酶活力，每組試驗做3 組平行，結(jié)果取平均值。

1.4.4 堿性蛋白酶預(yù)處理對產(chǎn)酶的影響 根據(jù)前期的研究[16]結(jié)果，①固定堿性蛋白酶添加量4 U/mg，分別處理2，3，4，5，6 h；②固定處理時間4 h，選擇添加量0，2，4，6，8 U/mg。用堿性蛋白酶在最適酶解溫度（45 ℃）和pH 值（10）條件下對蝦殼粉做預(yù)處理，對不同處理的培養(yǎng)基調(diào)pH 值至7.5，后續(xù)流程與1.4.3 節(jié)操作相同。

1.4.5 補充營養(yǎng)成分的單因素試驗 在上述得到的培養(yǎng)基中分別補充不同量的蔗糖 （0.20%，0.45%，0.70%，0.95%，0.12%）、硫酸銨（0.15%，0.20%，0.25%，0.30%，0.35%）、玉米漿（0.00%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%），調(diào)pH 值為7.5，后續(xù)流程與1.4.3 節(jié)操作相同。

1.4.6 發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響 在上述配制的最優(yōu)培養(yǎng)基下，考察搖床轉(zhuǎn)速的影響：固定1%接種量，2 d 發(fā)酵時間，選擇140，160，180，200，220 r/min 的搖床轉(zhuǎn)速；考察接種量的影響：固定180 r/min 搖床轉(zhuǎn)速，2 d 發(fā)酵時間，選擇1%，2%，3%，4%，5%的接種量；考察發(fā)酵時間的影響：固定1%接種量，180 r/min 搖床轉(zhuǎn)速，選擇發(fā)酵時間1，1.5，2，2.5，3 d。

1.4.7 Plackett-Burman 試驗 經(jīng)以上試驗篩選出的因素，用Design Expert 8.1 進(jìn)行Plackett-Burman 試驗設(shè)計，篩選對產(chǎn)CDA 酶活力最具影響的因素，以減少后期優(yōu)化試驗組數(shù)[17]。根據(jù)各因素對產(chǎn)酶影響的顯著性選定7 個因素，其編碼水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗設(shè)計因素及編碼水平Table 1 The factors and coding levels of Plackett-Burman test design

1.4.8 最陡爬坡試驗 為確定最具影響因素的最佳中心水平，利用最陡爬坡試驗逼近最佳試驗范圍，根據(jù)Plackett-Burman 試驗設(shè)計獲得的顯著影響因子和各因素的效應(yīng)值確定最陡爬坡試驗的因素、爬坡方向和試驗步長[18]。

1.4.9 Box-Behnken 試驗 采用Design Expert 8.1 進(jìn)行Box-Behnken 試驗設(shè)計[19]，以CDA 酶活力為響應(yīng)值，各顯著影響因子的水平為自變量，對最顯著影響的因素水平進(jìn)一步優(yōu)化。其編碼水平見表2。

表2 Box-Behnken 試驗因素及編碼水平Table 2 The factors and coding levels of Box-Behnken test

1.4.10 數(shù)據(jù)處理 用Design Expert 8.1 進(jìn)行Plackett-Burman 設(shè)計和Box-Behnken 試驗設(shè)計，并對結(jié)果進(jìn)行模型設(shè)計及方差分析。用SPSS Statistics 22.0 對單因素試驗進(jìn)行顯著性分析，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶預(yù)處理

堿性蛋白酶在蟹殼脫蛋白中的效果較好[16]。因小龍蝦殼與蟹殼在化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)上具有相似性，故選擇堿性蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果如圖2所示。

圖2 堿性蛋白酶處理時間及添加量對產(chǎn)CDA 酶活力的影響Fig.2 Effect of treatment time and addition amount of alkaline protease on CDA production

由圖2a 可見，隨著蛋白酶處理時間的延長，CDA 酶活力增加，在處理時間5 h 時達(dá)到最大值，處理時間4，5，6 h 時酶活力在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。由圖2b 可見，隨著蛋白酶添加量的增加，CDA酶活力增加，當(dāng)添加量為8 U/mg 時，增長趨于平緩，CDA 酶活力從未經(jīng)酶處理組的89.73 U/mL 增加到362.88 U/mL。

2.2 蝦殼粉培養(yǎng)基中補充營養(yǎng)成分對產(chǎn)酶的影響

為進(jìn)一步提高酶活力，在上述培養(yǎng)基中補充碳源、氮源和生長因子。按照文獻(xiàn)[13]中添加物及其添加量選擇硫酸銨、玉米漿、蔗糖作為補充成分，并以最佳水平為中心水平進(jìn)行單因素優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 補充營養(yǎng)物添加量對產(chǎn)CDA 酶活力的影響Fig.3 Effect of supplemental nutrient addition on CDA production

隨著硫酸銨添加量的增加，CDA 酶活力先升高后降低，在硫酸銨添加量為0.25%時，達(dá)到最大值619 U/mL。隨著玉米漿和蔗糖添加量的增加，CDA 酶活力均先增加，然后分別在添加量為0.75%和0.45%時趨于穩(wěn)定，最大值分別為582 U/mL 和666 U/mL。

2.3 發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

選擇搖床轉(zhuǎn)速、接種量和發(fā)酵時間作為考察指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖4a、4b 和4c 所示。

在受試范圍，由于接種量與搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶活力影響無顯著性差異（圖4a 和4b），因此它們不是影響產(chǎn)酶的主要因素。根據(jù)試驗結(jié)果，接種量和搖床轉(zhuǎn)速分別選擇3%和200 r/min。發(fā)酵時間對酶活力影響較大 （圖4c），隨著發(fā)酵時間的延長，酶活力先較快增加，2.5 d 時趨于平緩。

2.4 確定顯著影響因素的Plackett-Burman 試驗

通過Plackett-Burman 試驗設(shè)計，對蝦殼粉濃度，蔗糖、硫酸銨和玉米漿添加量，堿性蛋白酶添加量和處理時間，以及發(fā)酵時間7 個因素進(jìn)行篩選，結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及其響應(yīng)值Table 3 Plackett-Burman test design and its response value

圖4 發(fā)酵條件對產(chǎn)CDA 酶活力的影響Fig.4 Effects of fermentation conditions on CDA production

使用Design Expert 8.1 軟件對所得試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析和回歸擬合，結(jié)果見表4。各因素對紅球菌11-3 產(chǎn)CDA 酶活力影響的一次回歸方程為：

酶活力 （U/mL）=1900.0+384.9X1+247.1X2+72.8X3-149.3X4-192.4X5-7.9X6+68.3X7

方差分析模型的F 值和P 值分別為12.01和0.015，說明一次回歸方程模型顯著（P＜0.05）。經(jīng)Design Expert 8.1 軟件計算，本試驗的精密度為10.492＞4.0，說明該模型合理。7 個受試因素中，具有顯著影響（P＜0.05）的因素為蝦殼粉（X1）、蔗糖（X2）、堿性蛋白酶添加量（X5），由軟件得出其影響水平E 分別為769.82，494.11，-384.79，表明三者對紅球菌產(chǎn)酶影響分別為正效應(yīng)、正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)。

2.5 最陡爬坡試驗

用Plackett-Burman 試驗篩選出的對產(chǎn)CDA酶活力影響顯著的3 個因素設(shè)計最陡爬坡試驗，根據(jù)因素的正、負(fù)效應(yīng)確定最陡爬坡試驗的變化方向，參照因素效應(yīng)比例，結(jié)合實際各因素對產(chǎn)酶影響水平，確定登高步長，快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域，結(jié)果見表5。

表4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman test design

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 The steepest climbing test design and results

由表5可知，CDA 酶活力隨著登高步長的增長呈先增高后降低的趨勢。因試驗3 酶活力最高，故以試驗3 的3 個因子的水平作為響應(yīng)面試驗的中心點，做Box-Behnken 試驗。

2.6 Box-Behnken 試驗

Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果見表6，其方差分析結(jié)果見表7。

表6 Box-Behnken 試驗設(shè)計及其響應(yīng)值Table 6 Box-Behnken test design and its response value

表7 Box-Behnken 試驗設(shè)計方差分析表Table 7 Variance analysis of Box-Behnken test design

用Design Expert 7.1.6 對表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸模型為：

酶活力=2663.60+176.25A-36.75B-55.50C+39.50AB-4.00AC+56.50BC-184.80A2-250.30B2-199.30C2

方差分析顯示，模型顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.5681＞0.05），表明該模型可應(yīng)用于蝦殼粉濃度、蔗糖添加量、堿性蛋白酶添加量對產(chǎn)CDA酶活力的影響。R2=99.18%，表明模型的相關(guān)性較好；R2Adj=98.13%，表明響應(yīng)面98.13%的結(jié)果可由該模型表示。本試驗的變異系數(shù)為1.41%，說明模型擬合較好。本模型精密度為26.902＞4.0，說明蝦殼粉含量、蔗糖濃度、堿性蛋白酶添加量對產(chǎn)CDA酶活力影響的試驗數(shù)據(jù)可靠，可用此回歸方程對紅球菌在蝦殼粉培養(yǎng)基中產(chǎn)酶狀況的試驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

利用Design Expert 8.1 軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面的二維等高線和三維立體圖，如圖5所示。

圖5 蝦殼粉、蔗糖和堿性蛋白酶交互作用對紅球菌產(chǎn)CDA 酶活力的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the effects of the interactions of crayfish shell powder，sucrose and alkaline protease on the activity of CDA produced by Rhodococcus

由圖5可知，蝦殼粉、蔗糖以及堿性蛋白酶對CDA 酶活力的影響存在交互作用。由Design Expert 8.1 軟件分析得到：蝦殼粉與蔗糖、蔗糖與堿性蛋白酶交互顯著，蝦殼粉與堿性蛋白酶交互不顯著。蝦殼粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蔗糖添加量及堿性蛋白酶添加量分別為18.94%，0.99%和4.70 U/mg 時，產(chǎn)CDA 酶活力最大值為2 710 U/mL。為方便試驗操作，將蝦殼粉濃度、蔗糖添加量及堿性蛋白酶添加量分別按照19%，1%和5 U/mg 對試驗預(yù)測值進(jìn)行驗證，最終酶活力為2 723 U/mL，與預(yù)測值接近，說明該模型能較好地預(yù)測實際紅球菌在蝦殼粉培養(yǎng)基中的產(chǎn)CDA 酶活力。

經(jīng)以上優(yōu)化，紅球菌11-3 產(chǎn)CDA 酶活力高達(dá)2 723 U/mL。與起始的蝦殼粉培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力（50 U/mL）相比，增高了約53 倍，與文獻(xiàn)[13]中的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力較為接近。

3 結(jié)論

對19%蝦殼粉培養(yǎng)基，用堿性蛋白酶以5 U/mg 添加量處理4 h，釋放蝦殼粉中的蛋白質(zhì)。在其中添加1%蔗糖、0.25%硫酸銨和0.75%玉米漿。以3%的接種量接入紅球菌11-3，200 r/min 振蕩培養(yǎng)2.5 d，產(chǎn)CDA 酶活力高達(dá)2723 U/mL，相比起始的蝦殼粉培養(yǎng)基（酶活力50 U/mL），產(chǎn)酶活力提高了約53 倍，與文獻(xiàn)[13]中的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力相當(dāng)。以蝦殼粉為主要成分的培養(yǎng)基可產(chǎn)生較高酶活力的CDA，這將有利于降低生產(chǎn)成本，也為將來使用生物法從蝦殼中直接提取殼聚糖提供了研究基礎(chǔ)。