傳統(tǒng)蝦醬中酵母菌分離鑒定及碳源利用特性

徐文歡，吳若菡，李采嬋，呂 靜，紀(jì)超凡，梁會(huì)朋，孫澤平，林心萍

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連116034）

“蝦醬”是中國沿海地區(qū)及東南亞地區(qū)人們常用的調(diào)味料之一，是以毛蝦等小型蝦類經(jīng)腌制、搗碎、發(fā)酵制成的糊狀食品[1]，其滋味鮮美，回味無窮，具有獨(dú)特的風(fēng)味。我國的蝦醬生產(chǎn)主要集中在沿海地區(qū)，如遼寧、山東、天津、江蘇、廣東、海南等[2]。

蝦醬的發(fā)酵是一個(gè)較為復(fù)雜的化學(xué)變化過程，傳統(tǒng)的蝦醬生產(chǎn)通常采用自然發(fā)酵，且發(fā)酵過程受到季節(jié)、天氣、溫度等諸多不可控因素影響，使蝦醬的生產(chǎn)周期長，品質(zhì)不穩(wěn)定，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)外專家、學(xué)者對(duì)不同地區(qū)的蝦醬發(fā)酵工藝及品質(zhì)進(jìn)行研究。如：吳帥等[3]研究了低值蝦醬發(fā)酵中的風(fēng)味變化；苑寧等[4]闡述了蝦醬生產(chǎn)過程中的品質(zhì)變化，以及容易引起食品安全問題的不良因素。還有一部分學(xué)者對(duì)蝦醬中的微生物進(jìn)行分離，例如：石敏等[5]從侗族傳統(tǒng)蝦醬分離獲得一些具有蛋白酶、脂肪酶以及其它酶類的活性乳酸菌；孫業(yè)盈等[6]從蜢子蝦醬中分離鑒定出1株中度嗜鹽菌MKY2；連鑫等[7-8]從李錦記公司提供的廣東傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中分離鑒定出產(chǎn)香酵母和產(chǎn)蛋白酶霉菌；呂欣然等[9]在錦州傳統(tǒng)蝦醬中分離出蛋白酶嗜鹽菌。大連因處于黃、渤海交界海域這一獨(dú)特的地理位置，故造就了大連傳統(tǒng)蝦醬與眾不同的風(fēng)味和口感，這與其自身特有微生物環(huán)境有著密切聯(lián)系。過去對(duì)傳統(tǒng)蝦醬中酵母菌多樣性及特性的研究甚少，也鮮有對(duì)酵母菌碳源同化利用特性的研究。

本研究通過對(duì)大連蝦醬中酵母菌的分離純化，采用26S rDNA 菌株進(jìn)行種屬鑒定，對(duì)所分離的酵母進(jìn)行碳源同化特性研究，所得結(jié)果對(duì)蝦醬發(fā)酵優(yōu)良菌株的篩選以及工藝優(yōu)化有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品蝦醬，大連竹島食品公司的生制蝦頭醬。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

YEPD 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母10 g/L，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

碳源同化培養(yǎng)基：硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，瓊脂粉15 g/L，碳源（葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、檸檬酸、殼聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖）20 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃滅菌20 min。

甘露醇（分析純）、殼聚糖（分析純）、甘油（分析純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；N-乙酰-D-氨基葡萄糖，上海晨易生物科技有限公司；D-山梨糖醇，生工生物工程（上海）有限公司；檸檬酸，天津市石英鐘廠霸州市化工分廠；蔗糖（分析純）、乳糖（分析純）、葡萄糖（分析純），天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.3 儀器與設(shè)備

DRP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；PCR 儀，美國伯樂公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；凝膠成像系統(tǒng)，以色列DNR 公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分離純化 在無菌條件下，取5 g蝦醬于45 mL 無菌水中搖勻，過濾。取合適的梯度進(jìn)行稀釋，稀釋后溶液取0.2 mL，均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，封口后置于30 ℃培養(yǎng)48 h。選取菌落數(shù)為30～300 的平板，挑取清晰單菌落或不聚成堆菌落重新平板劃線分離，培養(yǎng)一定時(shí)間后，挑取單菌落，在PDA 平板上劃線純化，直至得到純種單菌落，觀察并記錄菌落形態(tài)，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 觀察分離純化后酵母菌的菌落形態(tài)特征，從顏色、光滑度、致密性等方面觀察并記錄。取典型菌落進(jìn)行鏡檢，于40 倍物鏡下觀察菌體形態(tài)并采集圖像。

1.4.3 酵母菌的碳源同化 共配制9 種碳源同化培養(yǎng)基，9 種碳源包括葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、檸檬酸、殼聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

將分離純化后的酵母菌分別接種于9 種培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)相同時(shí)間，取出后觀察各培養(yǎng)基上每種酵母菌的生長狀況，進(jìn)行對(duì)比，總結(jié)每種酵母菌適宜的碳源生長條件，并采集圖像。

1.4.4 菌株基因組的提取 取保藏在-20 ℃的菌株，加入1 mL 純凈水懸浮，13 000 r/min 離心30 s。再加入400 μL TES 和0.3 g 左右的玻璃珠，室溫放置5 min。冰浴1 min，用渦旋振蕩儀（最大功率）振蕩1 min，反復(fù)5 次。再加入200 μL 飽和酚溶液，200 μL 氯仿異戊醇，室溫作用5 min。冰浴1 min，振蕩1 min，反復(fù)5 次。13 000 r/min 4 ℃離心10 min。取上清，加入1/10 體積的3 mol/L 醋酸鈉，2 倍體積冰冷無水乙醇，-20 ℃沉淀20～60 min。13 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，顛倒反復(fù)洗滌沉淀，13 000 r/min離心2 min，棄上清，晾干。加入適量的TER（1 mL的TE 緩沖液中加入1 μL 10 μg/μL 的RNA 酶），37 ℃溫 育20 min。取1 μL 進(jìn)行電泳，與λ HindIII marker 電泳條帶進(jìn)行比較，采用凝膠成像儀觀察并采集圖像。

1.4.5 菌株26S rDNA PCR 擴(kuò)增 PCR 采用通用引物26S1：5 ’-GCATATCAATAAGCGGAG GAAAAG-3’，26S2：5’-GGTCCGTGTTTCAAGA CGG-3’進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體系 （50 μL）：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taq 酶0.5 μL，模板2 μL，超純水36.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃20 s，50℃30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；4℃∞。取PCR 產(chǎn)物5 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.6 DNA 測序及系統(tǒng)發(fā)育樹建立 PCR 產(chǎn)物的測序工作由生工生物工程（上海） 有限公司完成。將所得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)分析，得到序列后用軟件MEGA5.2 進(jìn)行分析，制作成系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦醬中酵母菌的分離與鑒定

2.1.1 菌落的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 以大連傳統(tǒng)蝦醬為原材料，以PDA 為培養(yǎng)基，共分離純化出8 株酵母菌。該8 株酵母經(jīng)過多次平板劃線分離純化，確定為純菌落，分別編號(hào)為Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8。對(duì)以上8 株酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和顯微鏡檢測，菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果如圖1所示，各自具體菌落形態(tài)學(xué)描述見表1。由圖1可見，這8株菌株中有2 株菌為紅色，從菌落形態(tài)上看，表面光滑，不透明，產(chǎn)生紅色色素。其余均為白色，表面光滑濕潤，不透明，多呈白色，菌落的透明度、顏色都有所差異，其中，有2 株白色菌株的菌落邊緣呈模糊狀態(tài)。通過鏡檢可知，所分離的菌株大小符合酵母菌的大小，可進(jìn)一步采用分子生物學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。

2.1.2 酵母菌的碳源同化試驗(yàn)結(jié)果 不同碳源對(duì)酵母菌的生長狀況有不同影響，本試驗(yàn)采用葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、檸檬酸、殼聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖9 種常用微生物培養(yǎng)基碳源試材，對(duì)大連傳統(tǒng)蝦醬中分離純化出的8 株酵母菌進(jìn)行碳源同化試驗(yàn)，總結(jié)最適生長碳源，以及不同碳源對(duì)不同酵母菌的影響。

圖1 蝦醬中酵母菌Y1～Y8 號(hào)鏡檢（40×）及菌落形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Microscopy（40×） and colony morphology of yeasts Y1-Y8 in shrimp paste

表1 酵母菌Y1～Y8 號(hào)的形態(tài)學(xué)特征Table 1 Morphological characteristics of yeasts Y1-Y8

將8 株酵母菌分別接種于9 種碳源培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)時(shí)間相同的條件下，對(duì)不同培養(yǎng)基上的不同菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。根據(jù)形態(tài)學(xué)結(jié)果可以看出，從碳源角度來看，葡萄糖和蔗糖幾乎適應(yīng)所有酵母菌的生長，并且菌落生長很快，菌落旺盛；氨基葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油作為碳源也可以使每種酵母菌生長，然而對(duì)不同種類的酵母菌的生長促進(jìn)情況不同，部分酵母菌生長速度較快且旺盛，部分酵母菌生長緩慢；殼聚糖培養(yǎng)基上沒有任何酵母菌的生長跡象。葡萄糖、蔗糖等[10]是最常用的碳源，然而其來源通常采用淀粉水解等方式獲得。開發(fā)新的可利用碳源，如氨基葡萄糖[11]可來源于甲殼素水解產(chǎn)物，甘油[12-13]可來源于生物柴油加工廢棄物等，有助于拓寬微生物的碳源譜，以降低原料成本。

根據(jù)表2可以得出結(jié)論，對(duì)于這8 株酵母，經(jīng)鑒定為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的菌株Y1、Y6，在以葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露醇、山梨糖醇和氨基葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中均可正常生長，其中在葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基中生長情況最為良好，而在乳糖、殼聚糖和檸檬酸培養(yǎng)基中不能生長；Y2 酵母菌株近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）在除乳糖和殼聚糖以外的其它碳源培養(yǎng)基中均能正常生長，且在葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和氨基葡萄糖培養(yǎng)基中生長情況最好；Y3 和Y4 已鑒定為同種酵母菌株龍貢毛孢子菌（Trichosporon domesticum），在除檸檬酸和殼聚糖以外的其它碳源下均能正常生長，其中在以葡萄糖、乳糖、蔗糖和氨基葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長情況最好；Y5、Y7 和Y8 已鑒定為同種酵母菌株漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii），在除乳糖和殼聚糖以外的其它碳源下均能正常生長，在以葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和氨基葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長情況最好。由表2可見，從傳統(tǒng)蝦醬中分離出的菌株，普遍具有能夠利用氨基葡萄糖的特性，這預(yù)示著這些菌株具有利用氨基葡萄糖作為碳源的潛質(zhì)[11]。從這8 種菌株碳源利用的分析可見，葡萄糖和蔗糖的碳源利用譜最廣，殼聚糖的碳源利用譜最窄[14]。這些微生物的挖掘，可為之后開發(fā)蝦醬發(fā)酵劑奠定菌株基礎(chǔ)。

表2 8 株酵母菌碳源同化試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of 8 yeast carbon source assimilation

2.2 酵母菌DNA 提取及26S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以提取的8 株酵母菌基因組為模板，采用通用引物26S1 和26S2 擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和凝膠成像系統(tǒng)檢測結(jié)果如圖2所示，可以觀察到所有泳道的600 bp 左右位置均出現(xiàn)了一條清晰條帶且特異性強(qiáng)。將樣品中的PCR 片段進(jìn)行回收純化后，送測序公司進(jìn)行測序。

圖2 8 株酵母菌26S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of 26S rDNA PCR amplification result from eight isolated yeasts

2.2.1 蝦醬中26S rDNA 序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 測序結(jié)果利用BLAST 工具，與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性對(duì)比，比對(duì)結(jié)果如表3所示。由表3結(jié)果可知，菌株Y1 與膠紅酵母FJ009291.1 同源性達(dá)到100%，菌株Y6 與膠紅酵母FJ515247.1 同源性達(dá)到99%，可鑒定Y1、Y6 為膠紅酵母；菌株Y2 與近平滑假絲酵母EU605809.1 同源性達(dá)到100%，可鑒定其為近平滑假絲酵母；菌株Y3、Y4 與龍貢毛孢子菌JN939470.1 同源性達(dá)到99%，可鑒定其為絲孢酵母（Trichosporon domesticum）；菌株Y5 與漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）JX649975.1 同源性達(dá)到100%，菌株Y7、Y8 與漢遜德巴利酵母LC219505.1 同源性達(dá)到100%，可鑒定菌株Y5、Y7、Y8 為漢遜德巴利酵母。

表3 酵母菌26S rDNA 序列分析結(jié)果Table 3 Results of 26S rDNA sequence analysis for 8 yeasts strains

根據(jù)同源性分析結(jié)果，選擇同源性較高的不同參考菌株的序列，使用本地軟件Mega7.0，運(yùn)用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，菌株膠紅酵母FJ009291.1與膠紅酵母FJ515247.1 在同一分支上，親緣關(guān)系最近，形成第1 類群；菌株絲孢酵母JN939470.1形成第2 類群；菌株近平滑假絲酵母EU605809.1形成第3 類群；菌株漢遜德巴利酵母JX649975.1與漢遜德巴利酵母LC219505.1 在同一分支上，親緣關(guān)系最近形成第4 類群。所有分離株與相對(duì)應(yīng)的參考菌株同源性都在99%和100%，證明酵母菌26S rDNA 序列分析結(jié)果準(zhǔn)確，置信度高。

3 結(jié)論

圖3 大連蝦醬酵母分離株26S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast from Dalian shrimp paste based on 26S rDNA sequence

本試驗(yàn)中分離并鑒定的酵母菌均被報(bào)道在發(fā)酵食品中與食物的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物產(chǎn)生互相作用，對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味、口感、安全和營養(yǎng)方面等產(chǎn)生了有益作用。例如，Salgado 等[15]對(duì)葡萄酒中漢遜德巴利酵母產(chǎn)生揮發(fā)性化合物的研究表明，該酵母可產(chǎn)生對(duì)應(yīng)10 類的揮發(fā)性化合物：萜烯、高級(jí)醇、C6 醇、醛類、揮發(fā)性物酸、乙酸酯、乙酯、揮發(fā)性酚、硫化合物和烴等，這些化合物可使葡萄酒的香氣更加濃醇，對(duì)改善口感起到了作用。李亞莉等[16]采用近平滑假絲酵母接菌普洱茶，結(jié)果表明，接菌的發(fā)酵茶樣中主要功能成分含量均較自然發(fā)酵茶葉中的含量高，具有傳統(tǒng)普洱茶的品質(zhì)風(fēng)味，且在香氣和滋味方面有自身的特點(diǎn)，滋味醇和、厚滑，香氣純正略帶乳香，說明近平滑假絲酵母對(duì)發(fā)酵普洱茶的風(fēng)味、口感等起到一定的改善作用。此外，還有研究表明，海洋膠紅酵母[17]具有抗菌、抑霉等特點(diǎn)，可提高發(fā)酵食品的品質(zhì)，延長其食品保質(zhì)期。毛俊霞[18]研究發(fā)現(xiàn)，膠紅酵母中富含多種氨基酸，而且天冬氨酸、谷氨酸、丙氨基酸的含量較高，粗蛋白的含量為37.8%±0.52%，且由于其自身產(chǎn)類胡蘿卜素等特點(diǎn)，賦予了食品抗氧化性及新的營養(yǎng)特性，具有提升營養(yǎng)價(jià)值的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)的這些酵母，推測可能在蝦醬特殊氣味、營養(yǎng)等的形成方面具有重要作用，可促進(jìn)蝦醬中的蛋白質(zhì)分解形成氨基酸，增加其獨(dú)特鮮味，賦予蝦醬濃郁的口感；此外，還具有提高其營養(yǎng)價(jià)值的作用，可能對(duì)發(fā)酵食品保質(zhì)期的延長起到促進(jìn)作用。

碳源同化能力[19]是判斷微生物利用不同碳源能力的指標(biāo)，是微生物進(jìn)行鑒定的生理生化指標(biāo)，將為鑒定微生物的輔助特征提供有益補(bǔ)充。本文研究發(fā)現(xiàn)，膠紅酵母對(duì)葡萄糖和蔗糖的利用能力較好，對(duì)甘油的利用率次之，不能利用乳糖和殼聚糖。毛俊霞[18]的研究表明，發(fā)現(xiàn)在重慶不同果園土壤中分離的膠紅酵母對(duì)蔗糖、甘露醇和甘油的利用率比較高；李新玲等[20]在自制酸駝乳中發(fā)現(xiàn)了1株膠紅酵母，其碳源同化試驗(yàn)也表明，膠紅酵母對(duì)蔗糖的利用程度較高。在蝦醬中發(fā)現(xiàn)的膠紅酵母的碳源同化能力與其他研究人員的結(jié)果類似。Rivas 等[21]在玉米芯中提取的漢遜德巴利酵母優(yōu)先利用葡萄糖，其次是木糖以及阿拉伯糖等；Koganti 等[22]發(fā)現(xiàn)，漢遜德巴利酵母可高效利用甘油，高選擇性地生產(chǎn)阿拉伯糖醇，產(chǎn)量達(dá)55%，說明甘油為漢遜德巴利酵母的優(yōu)良碳源，可能還對(duì)于代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有一定的選擇性。本研究也發(fā)現(xiàn)，漢遜德巴利酵母優(yōu)選葡萄糖、蔗糖及山梨糖醇，此外，該酵母對(duì)甘油的利用比較顯著。絲孢酵母和近平滑假絲酵母對(duì)碳源的選擇性也與文獻(xiàn)報(bào)道一致，張玉瑧等[23]分離獲得的1 株絲孢酵母對(duì)葡萄糖和蔗糖利用效果最好；Preziosi-Belloy 等[24]用近平滑假絲酵母菌發(fā)酵半纖維素糖，在葡萄糖質(zhì)量濃度和甘露糖質(zhì)量濃度分別為27 g/L 和6 g/L 時(shí)，可正常生長，當(dāng)高于此濃度時(shí)，受到抑制，因此可以看出，葡萄糖和甘露糖為近平滑假絲酵母的碳源。碳源利用程度[25]是評(píng)價(jià)微生物特性的指標(biāo)，本試驗(yàn)結(jié)果將為今后篩選優(yōu)良的發(fā)酵菌株及發(fā)酵生產(chǎn)菌株碳源的選擇提供一定參考。

從傳統(tǒng)蝦醬中共分離出8 株酵母菌，通過對(duì)該8 株酵母菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果為2 株膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa），1 株近平滑假絲酵母 （Candida parapsilosis），3 株漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），2 株絲孢酵母（Trichosporon domesticum）。對(duì)8 株酵母菌的碳源同化試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖和蔗糖為酵母菌生長的最優(yōu)碳源；氨基葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油雖然可以使每種酵母菌生長，但利用程度不同；乳糖和檸檬酸只能促進(jìn)部分種類酵母菌生長；而殼聚糖不宜用作酵母菌生長的碳源。這些微生物的挖掘，可為今后開發(fā)蝦醬發(fā)酵劑奠定菌株基礎(chǔ)，同時(shí)，也對(duì)促進(jìn)蝦醬中微生物資源利用，篩選合適發(fā)酵劑，推動(dòng)大連傳統(tǒng)蝦醬產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到積極作用。