蔡桂萍，劉寶玲，周雅莉，鄧咪咪，高慧玲，李 騰，張 莉，李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

大豆（Glycine max）是我國甚至全球重要的油料作物，可食用和作為飼料［1］。大豆油是全世界食用油的主要來源之一，約占總植物油產(chǎn)量的28%［2］。其主要由5 種脂肪酸組成，包括2 種飽和脂肪酸［棕櫚酸（C16:0，約11.38%）、硬脂酸（C18:0，約4.29%）］和3 種不飽和脂肪酸［油酸（C18:1Δ9，約15.66%）、亞油酸（C18:2Δ9,12，約47.33%）和亞麻酸（C18:3Δ9,12,15，約15.40%）］［3-4］。其中高含量的亞油酸可以降低血液中的膽固醇，預(yù)防心腦血管疾病。作為一種優(yōu)異的食用植物油，大豆油在全球的需求量日益增加。提高大豆油的產(chǎn)量始終是遺傳育種及大豆生產(chǎn)的一個(gè)主攻領(lǐng)域［5］。深入研究大豆種子油脂的生物合成及積累機(jī)制可為大豆遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive factor）蛋白家族包含220 多個(gè)成員，被認(rèn)為是植物界最重要的轉(zhuǎn)錄因子超家族，其典型特征是含有60～70 個(gè)氨基酸組成的高度保守的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即AP2結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域由3 個(gè)β-轉(zhuǎn)角（beta turn）和1 個(gè)α-螺旋（alpha helix）構(gòu)成?；贏P2 結(jié)構(gòu)域的拷貝數(shù)，AP2/ERF 家族可簡單分為4 個(gè)亞家族：AP2 亞家族、ERF亞家族、DREB亞家族、RAV 亞家族［6］。

WIN1（WAX INDUCER1/SHINE1）具有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，又名SHN1，屬于ERF-B6 亞家族。此亞家族還具有其他2 個(gè)成員，即SHN2、SHN3，且功能與WIN1 相似［7-9］，主要參與植物蠟質(zhì)和角質(zhì)的生物合成過程，可提高植物的抗逆性。WIN1也參與植物非生物脅迫反應(yīng)，激活植物激素等信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控下游功能基因的表達(dá)［10］。蠟質(zhì)和三酰甘油（triacylglycerol，TAG）都屬于酯類化合物，因此，WIN1 在調(diào)控蠟質(zhì)時(shí)也能同時(shí)調(diào)控若干個(gè)油脂基因，顯著影響植物的油脂積累。近年來，人們已經(jīng)從甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大麥（Hordeum vulgare）等植物中分離得到了WIN1基因，并驗(yàn)證了該蛋白的活性。例如：過表達(dá)甘藍(lán)型油菜BnWIN1基因后，其蠟質(zhì)含量增加了20%～22%，種子的含油量亦增加了8%［11］。在酵母中過表達(dá)擬南芥WIN1基因，使得酵母棕櫚油酸（C16:1）含量下降10%，然而C16:0、C18:1、C18:0、C20均有上升，且C20 含量增加了20%左右［7］。在轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中組成型表達(dá)WIN1，與對(duì)照植物相比，其葉片表皮蠟質(zhì)累積提高4.5 倍，莖表皮蠟質(zhì)也有明顯的增加［12］。已有研究顯示，植物WIN1基因的表達(dá)模式具有時(shí)空特異性。如其在擬南芥花序、根中高表達(dá)，而在莖、長角果、蓮座葉中低表達(dá)［8，13］；其在甘藍(lán)型油菜花蕾的表達(dá)量最高，在葉、根、發(fā)育中的種子、角果壁中的表達(dá)高于莖和第10 天的角果［11］。進(jìn)一步深入研究不同植物中這些差異表達(dá)WIN1基因的具體生物學(xué)功能，有助于全面解析植物WIN1轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及作用機(jī)制。

為解析大豆WIN1 轉(zhuǎn)錄因子是否參與大豆油脂生物合成以及脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程的調(diào)控，鑒定可用于大豆遺傳改良的優(yōu)異基因源，本文通過同源比對(duì)分析，從大豆基因組中鑒定獲得一個(gè)Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子，并克隆到該基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF），應(yīng)用生物信息學(xué)工具系統(tǒng)分析其蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)等。采用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR（semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，sqRT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)分析Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子在大豆不同組織和不同發(fā)育種子中的時(shí)空表達(dá)模式以及對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。研究結(jié)果預(yù)示著GmWIN1-6 可作為一個(gè)遺傳修飾靶標(biāo)，進(jìn)一步應(yīng)用于提高大豆種子油脂富集和大豆抗脅迫的育種實(shí)踐中［14］。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用的大豆品種Jack，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。試驗(yàn)取材為：兩周齡的幼苗、根、莖、幼葉、盛花期的花、幼嫩的豆莢以及開花后25 d（種子1）、35 d（種子2）、45 d（種子3）的大豆種子；鹽脅迫處理0、2、6、9、12 h 的大豆幼苗葉片。所有樣品經(jīng)液氮速凍后儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 大豆GmWIN1-6轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及結(jié)構(gòu)分析

選用模式生物擬南芥AtWIN1（At1g15360）的蛋白序列作為檢索序列blastp 大豆基因組數(shù)據(jù)庫soybase（https://soybase.org/），以此獲得GmWIN1-6轉(zhuǎn)錄因子的基因組序列、編碼序列（coding sequence，CDS）、氨基酸序列及染色體的位置信息。將檢索到的GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的CDS 用NCBI-ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）數(shù)據(jù)庫檢測是否具有完整的ORF。將檢索到的GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，鑒定GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域。利用網(wǎng)站Gene Structure Display Server（http://gsds.gao-lab.org/index.php）對(duì)GmWIN1-6轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。

1.2.2 大豆GmWIN1-6蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

用ExPASy 數(shù)據(jù)庫（https://www.expasy.org/）中的ProtParam 預(yù)測GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)目等理化性質(zhì)［15］，同時(shí)采用Ex-PASy 數(shù)據(jù)庫中的ProtScale 預(yù)測GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的疏水性。通過在線工具TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測大豆GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，利用SOPMA 網(wǎng)站（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.htmL）預(yù)測GmWIN1-6轉(zhuǎn)錄因子的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）對(duì)Gm-WIN1-6轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析并建模。

1.2.3 大豆GmWIN1-6 蛋白保守域鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中調(diào)取水稻（Oryza sativa）、紫花苜蓿（Medicago truncatula）、大麥和擬南芥的WIN1 蛋白序列，利用軟件GeneDoc 進(jìn)行多序列比對(duì)（各物種的WIN1 信息見表1）。運(yùn)用MEGA7.0軟件對(duì)擬南芥AtWIN1、AtSHN3、AtSHN2、水稻Os-SHN1、紫花苜蓿MtWIN1、大麥HvWIN1和大豆Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列進(jìn)行建樹，采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢驗(yàn)值設(shè)置為1 000個(gè)循環(huán)［16］。

表1 各物種WIN1信息Tab. 1 Information of WIN1 in different species

1.2.4 大豆RNA的提取、cDNA 的合成及基因克隆

根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司的Trizol 法提取大豆各組織的總RNA。利用江蘇省愛必夢(mèng)生物科技有限公司的5×All-In-One RTMasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA 為模板，使用基因特異引物及2×GPV8 HF Polymerase Master（安徽通用生物有限公司）高保真酶擴(kuò)增目的基因的ORF，目的片段經(jīng)凝膠回收和純化后連入pMD18-T 載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。選取陽性菌，并在通用生物公司測序驗(yàn)證。

1.2.5 大豆GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析

使用Primer6.0 軟件，依據(jù)GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物（表2），采用NCBI 中的Primer-BLAST對(duì)引物進(jìn)行鑒定。以上述大豆各組織的cDNA 為模板，利用GmWIN1-6 的特異性引物進(jìn)行sqRT-PCR 和qRT-PCR 分析。選用大豆Actin作為內(nèi)參基因。依照TRAN 2×Easy Taq PCR Super Mix說明書提供的方法進(jìn)行sqRT-PCR 分析。反應(yīng)體系為：cDNA 模板0.5 μL，2×Easy Taq PCR Super Mix 5.0 μL，正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，Nucleasefree Water 2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；變性94℃ 30 s，退火30 s，延伸72℃ 30 s，30～35 個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10 min。

依照TB Green? Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus，TaKaRa公司）說明書提供的方法進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系為：cDNA 模板1.0 μL，TB Green-Premix Ex Taq 5.0 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ （50×） 0.2 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃ 3 s，退火58℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在Bio-RadCFX96 TM熒光定量PCR 儀上進(jìn)行。用公式2-ΔΔCq計(jì)算基因表達(dá)量，利用IBM SPSS Statistics 19 進(jìn)行差異顯著性分析。

表2 檢測GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的特異性引物Tab. 2 Specific primers for detecting the expression of GmWIN1-6 transcription factors

1.2.6 大豆幼苗的鹽脅迫處理

取大豆品種Jack 的種子，在黑暗條件下進(jìn)行萌發(fā)。將種子種在營養(yǎng)土中，在光照培養(yǎng)箱中生長。設(shè)置培養(yǎng)箱條件為溫度25℃，相對(duì)濕度60%，光照/黑暗為14 h/10 h。播種14 d 后，篩選并保留長勢良好、狀態(tài)一致的幼苗，將幼苗移入200 mmol/L NaCl溶液中處理0、2、6、9、12 h 作為鹽脅迫［17］。液氮速凍后-80℃?zhèn)溆谩⒄?.2.4、1.2.5 中的方法分別提取不同時(shí)間的鹽脅迫幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行GmWIN1-6的qRT-PCR 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及基因結(jié)構(gòu)分析

利用AtWIN1 蛋白序列在大豆基因組數(shù)據(jù)庫中搜索，鑒定同源WIN1 蛋白。根據(jù)與AtWINI 的蛋白序列的相似性評(píng)分，將獲得的GmWIN1 轉(zhuǎn)錄因子命名為GmWIN1-6。通過SMART 和CDD 數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的GmWIN1-6 蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析，發(fā)現(xiàn)GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子中含有1 個(gè)典型的AP2 保守結(jié)構(gòu)域。利用在線Gene Structure Display Server 網(wǎng)站工具對(duì)GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子基因組DNA 進(jìn)行內(nèi)含子、外顯子分析，發(fā)現(xiàn)該基因具5'和3'非翻譯區(qū)，含2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子（圖1）。這與擬南芥AtWIN1 結(jié)構(gòu)相似，應(yīng)行使相同的功能。

2.2 大豆GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子CDS 的克隆

已知GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子在花中高表達(dá)，故以花的cDNA 為模板，通過高保真酶擴(kuò)增目的序列，并將其與載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，涂篩選板挑取單克隆進(jìn)行PCR 和測序驗(yàn)證。單克隆菌液PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示（圖2），以空載為對(duì)照，GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的3 個(gè)單克隆大腸桿菌PCR 產(chǎn)物條帶清晰，大小為529 bp。測序結(jié)果顯示，氨基酸沒有變化，只有部分堿基發(fā)生了變化，說明Gm-WIN1-6克隆成功。

2.3 大豆GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)分析

圖1 GmWIN1-6轉(zhuǎn)錄因子的基因結(jié)構(gòu)Fig. 1 Gene structure of GmWIN1-6 transcription factor

表3 GmWIN1-6 蛋白的理化性質(zhì)Tab. 3 Physicochemical properties of GmWIN1-6 protein

圖2 單克隆大腸桿菌PCR驗(yàn)證Fig. 2 PCR verification of monoclonal Escherichia coli

用ExPASy 數(shù)據(jù)庫中的工具ProtParam 對(duì)Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析。該蛋白長度為176 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為19.81 kD，等電點(diǎn)為9.54，屬于不穩(wěn)定蛋白（表3）。用ProtScale 軟件預(yù)測GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的疏水性，發(fā)現(xiàn)其親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，屬于親水性蛋白（圖3）。用TMHMM 軟件預(yù)測Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，說明GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子蛋白不是一個(gè)膜蛋白［18］。

圖3 GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子蛋白的疏水性Fig. 3 Hydrophobicity of GmWIN1-6 transcription factor protein

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示（表4），GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列中α-螺旋、延伸鏈（extended strand）、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲（random coil）分別占二級(jí)結(jié)構(gòu)的31.82%、13.64%、6.25%、48.30%，無規(guī)則卷曲所占比例最高，推測其作用主要為連接其他二級(jí)結(jié)構(gòu)元件［19］。用SWISS-MODEL 軟件分析GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4），發(fā)現(xiàn)GmWIN1-6 蛋白與AtERF96 蛋白結(jié)構(gòu)相似性為56.06%，推測其具有相似的功能。

表4 GmWIN1-6 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Tab. 4 The secondary structure of GmWIN1-6 protein

圖4 GmWIN1-6 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 4 Tertiary structure of GmWIN1-6 protein

2.4 大豆GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5 大豆GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of GmWIN1-6 transcription factor

利用DNAMAN 軟件將GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列與4 個(gè)不同物種（擬南芥、水稻、紫花苜蓿、大麥）的6 個(gè)WIN1 蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。比對(duì)結(jié)果（圖5a）顯示，7 個(gè)WIN1 轉(zhuǎn)錄因子在N 端均有一段約63 個(gè)氨基酸的保守序列，即AP2 結(jié)構(gòu)域，為主要功能結(jié)構(gòu)域。GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子包含了AP2 結(jié)構(gòu)域的所有特征。GmWIN1-6還存在其他2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是中間基序（middle motif，mm）和C端基序（C-terminus motif，cm）。Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的中間基序與AtWIN1 的中間基序的關(guān)鍵氨基酸最為相似，C 端基序與其他4 個(gè)物種幾乎一致，預(yù)測其具有相同的功能。利用MEGA 7.0 軟件將GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子與其他4 個(gè)物種的WIN1 轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明（圖5b），GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AtWIN1 的親緣關(guān)系較近。

2.5 大豆GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的表達(dá)模式

用超微量核酸分析儀測定提取到的大豆各組織RNA 的濃度及純度，A260/A280的值均在2.0 左右，說明所提RNA 的純度較高。凝膠成像儀觀察分離的RNA 的電泳結(jié)果顯示，所提取大豆各組織的RNA 條帶清晰，質(zhì)量好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析Fig. 6 Expression analysis of GmWIN1-6 transcription factor

圖7 大豆幼苗鹽處理的不同階段及GmWIN1-6轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析Fig. 7 Different stages of soybean seedlings under salt treatment and GmWIN1-6 expression analysis

為鑒定GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能，本文以大豆根、莖、葉、花、莢、種子1、種子2、種子3的cDNA 為模板，采用基因特異性引物進(jìn)行sqRTPCR 和qRT-PCR。sqRT-PCR 結(jié)果顯示（圖6a），Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子在根、莖、葉中幾乎不表達(dá)，在花中表達(dá)最高。隨著種子的發(fā)育，該基因表達(dá)逐漸上調(diào)，在種子發(fā)育中后期表達(dá)量較高，且與種子油脂積累時(shí)期相吻合。qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)一步表明（圖6b），該基因在花中的表達(dá)量最高，其次是種子發(fā)育中后期。這與sqRT-PCR 結(jié)果幾乎一致，說明Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子可能在花的發(fā)育和種子油脂積累的過程中行使功能。

2.6 大豆幼苗鹽脅迫下GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)譜

鹽脅迫條件下，GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子在大豆幼苗的定量分析結(jié)果顯示（圖7），其在2、6、9、12 h與0 h 處理相比有明顯的變化，是先下降再上升，而后再下降的一個(gè)過程，在6 h 達(dá)到極值。說明Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子可能參與大豆幼苗鹽脅迫響應(yīng)相應(yīng)機(jī)制的調(diào)控。

3 討論

近年來，植物油在生物柴油、食品保健、化工制藥等方面的應(yīng)用越來越廣泛，需求大于供給的市場極大地促進(jìn)了油脂合成相關(guān)基因的研究［20］。WIN1作為蠟質(zhì)、油脂合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，已成為人們研究的重點(diǎn)。現(xiàn)今，WIN1 轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、甘藍(lán)型油菜等植物中均有所報(bào)道，而大豆的WIN1 研究還未深入，因此有必要在大豆中進(jìn)行更深入的研究。大豆作為重要的油料作物，對(duì)其研究可以為提高大豆油脂含量提供理論依據(jù)。

本文根據(jù)擬南芥AtWIN1 序列，在大豆數(shù)據(jù)庫中獲得GmWIN1-6 成員，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。該蛋白由176 個(gè)氨基酸組成，屬于親水性蛋白。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的無規(guī)則卷曲較多，預(yù)測其主要用于連接其他二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與AtERF96 相似性很高。多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，Gm-WIN1-6 在N 端有一段約63 個(gè)氨基酸的保守序列，與其他物種的WIN1 轉(zhuǎn)錄因子相似性很高，中間基序和C端基序與其他物種也很相似。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AtWIN1 的親緣關(guān)系很近。綜上可推測，GmWIN1-6蛋白也具有WIN1的活性。

本研究證實(shí)，GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子在大豆不同組織中均有表達(dá)，在根、莖、葉、莢中表達(dá)較低，在花中的表達(dá)量最高。已有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)高等植物均是在花蕾中具有較高的表達(dá)［11］，推測Gm-WIN1-6 可能與TAG 參與有性生殖相關(guān)。TAG 占據(jù)了花粉塊質(zhì)量的30%～40%，但其在花粉中的具體作用還不清楚，可能是為花粉管生長所需膜脂的快速合成提供脂肪酸原料［21］。同時(shí)在整個(gè)種子發(fā)育階段，尤其是中后期，GmWIN1-6 也具有較高的表達(dá)量，與種子油脂積累時(shí)期吻合，推測其參與了種子形成過程中油脂的積累。進(jìn)而本文又對(duì)Gm-WIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了鹽脅迫研究，發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下，GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子具有響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制，可能激活了植物激素信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)下游功能基因的表達(dá)［22-23］?？傮w而言，GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子不僅在蠟質(zhì)、脂質(zhì)合成方面起到關(guān)鍵作用，還在脅迫響應(yīng)機(jī)制中起調(diào)控作用。

轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育過程中有重要作用。大部分轉(zhuǎn)錄因子都有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和DNA 結(jié)合區(qū)，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)起激活作用還是抑制作用。一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以參與調(diào)控多個(gè)相關(guān)基因，從而達(dá)到改變植物性狀的目的［24］。本文主要針對(duì)GmWIN1-6 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分析，對(duì)其下游功能基因的研究仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究結(jié)果為了解油脂積累過程中的機(jī)制和抗鹽性以及后期轉(zhuǎn)基因功能分析奠定了基礎(chǔ)。